植物组织培养课程论文--——百合的组织培养研究.docx

百合的组织培养

天津师范大学
生命科学学院

《植物组织培养》课程论文
——百合的组织培养研究

Ⅱ

摘要：百合是百合科百合属，多年生草本球根植物。是著名的观赏花卉，可食用，有很高的利用价值。利用组织培养进行繁育是百合无毒化和商品化的必要途径。由于百合的常规繁殖率低，易感染病毒，所以对繁殖技术提出了更高的要求，人工繁殖技术对百合具有重要的意义。本实验主要通过植物组织培养手段，以MS为基本培养基，以百合鳞茎为外植体，对其进行灭菌消毒，并置于温度为25摄氏度，湿度为80%的温箱中，8小时睡眠16小时光照的情况下进行培养。随后观察其生长情况，并拍照记录。本次实验外植体成功发育成愈伤组织，并长出芽。此实验主要在于掌握植物组织培养技术，了解其方法过程。

关键词：组织培养；百合；无菌操作

目录
摘要 I
一、文献综述 1
1.1百合组织培养技术进展 1
1.2植物组织培养概述 1
参考文献： 2
二、百合植物组织培养 3
2.1实验试剂 3
2.2仪器 3
2.3生物材料 3
三、实验步骤 3
3.1培养基的配制 3
3.1.1配制培养基母液的配制方法 3
3.1.2 完全培养基的制备 4
3.2兰州百合外植体灭菌处理和初代培养 4
四、实验结果及讨论 5
4.1实验结果 5
4.2讨论 10

Ⅱ

百合的组织培养
一、文献综述
1.1百合组织培养技术进展
百合植物资源丰富，栽培历史悠久，花色多样，它不仅适用于庭院栽培，布置花境，也可盆栽观赏，并早已成为花卉研究领域的佼佼者。百合虽然观赏性很高，但大多抗性很弱，尤其抗寒性。一般在东北地区种植商品百合时， 每年秋季必须起球，窖藏或者冷库存放，这大大增加了百合的生产成本，限制了东北地区花卉业的发展。随着百合在国内外鲜切花市场的走俏，百合花生产和消费逐年增加，但由于百合种球繁殖率低，病毒侵染造成退化，难于满足切花生产需要。目前主要采用组织培养进行百合脱毒和快速繁殖，以促进百合商品种球的生产。但是百合试管苗小鳞茎较小，结鳞茎时间较长，移植成活率低，制约了工厂化商品生产。目前国内繁殖百合主要通过进口鳞茎进行繁殖。但是市场售价较高，而且有时鳞茎质量难以保证、繁殖率低、易造成鳞茎退化。采用组织培养的方法在很短时间内可以得到大量的组培苗，而且一般在第二年即可开花。[1]
1.2植物组织培养概述
植物组织培养是一种将植物体的部分细胞或组织与母体分离，在适当的条件下加以培养，使它们能够生长、发育、分化与增殖的技术。原理是来自植物细胞的全能性分化能力，也就是植物体内的某一类细胞，能够独立发育并且分化成为完整的植物成体。植物组织培养能够以少量的母体培养出大量的植物，这使植物组织培养有许多的用途，例如基础植物学与遗传学研究，以及农业上的育种与品种保留。[2]
植物组织培养是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官、组织或细胞以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株。1902年，德国著名植物学家G.Haberlanclt根据细胞学理论，大胆地提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直到单个细胞，即植物体细胞，在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖，发育成完整植株的潜力的观点。1943年，美国人White在烟草愈伤组织培养中，偶然发现形成一个芽，证实了G.Haberlanclt的论点。
组织培养选用的基础培养基一般较多采用的是MS。采用固体培养基较多，因为相比液体培养基，固体培养基在操作上更方便，被广泛使用。在基础培养基里添加一定的外源激素，可以诱导出愈伤组织、胚状体、不定芽、根等器官，最终可获得再生植株或者次生产物。常用的激素类型有生长素类、细胞分裂素类、赤霉素等。[3]

参考文献：
[1]:周威，《百合的组织培养》，科技向导，2011年第09期
[2]:https://zh.wikipedia.org/wiki/%E6%A4%8D%E7%89%A9%E7%B5%84%E7%B9%94%E5%9F%B9%E9%A4%8A
[3]:梁一池，杨华，《植物组织培养技术的研究进展》，福建林学院学报，2002, 22(1):93-96

二、百合植物组织培养
2.1实验试剂
　　NH4NO3, KNO3, CaCl2•2H2O, MgSO4•7H2O, KH2PO4, KI, H2BO3，MnSO4•4H2O, ZnSO4•7H2O, Na2•MoO4•2H2O, CuSO4•5H2O, CoCl2•6H2O, Na2•EDTA•2H2O，FeSO4•7H2O，烟酸，甘氨酸, 盐酸硫胺素, 肌醇, 盐酸吡哆醇；琼脂，蔗糖，蒸馏水，NAA，6-BA，1mol/L HCl，1mol/L NaOH；75%酒精。
2.2仪器
　　冰箱、天平、酸度计或pH试纸、电炉、高压灭菌锅、超净工作台、光照培养箱、三角瓶、容量瓶、量筒、移液管、烧杯、培养皿、滤纸、牛皮纸、绳、玻璃棒、镊子、刀等。
2.3生物材料
　　百合

三、实验步骤
3.1培养基的配制
　3.1.1配制培养基母液的配制方法
a) 大量元素的配制：依次称取KNO3 19g、NH4NO3 16.5g、MgSO4•7H2O 3.7g、KH2PO4 0.17g、CaCl2•2H2O 4.4g ,分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，以防互相发生反应，最后用容量瓶定容至1L,转入试剂瓶中，贴上标签，置冰箱冷藏保存。
b) 微量元素的配制：依次称取MnSO4•4H2O 2.23g、ZnSO4•7H2O 0.86g、H3BO3 0.32g、KI 0.083g、Na2Mo•2H2O 0.025g、CuSO4•5H2O 0.0025g、CoCl2•6H2O 0.0025g ,分别用少量的蒸馏水彻底溶解，再将它们混溶，最后用容量瓶定容至1L,转入试剂瓶中，贴上标签，置冰箱冷藏保存。
c) 铁盐的配制：称取FeSO4•7H20 1.390g、Na2•EDTA1.856g，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，再将它们混溶，最后用容量瓶定容至500ml，保存在玻璃瓶中,贴上标签，置冰箱冷藏保存。
d) 有机物母液的配制: 依次称取甘氨酸0.1g、盐酸硫胺素 0.005g、盐酸吡哆醇0.025g、烟酸0.025g、肌醇5g，用少量蒸馏水充分溶解，最后定容至250ml,转入试剂瓶中，贴上标签，置冰箱冷藏保存。
e) 激素溶液的配制：分别称取6-BA、NAA各10mg，将6-BA用1ml的0.1mmol/L的NaOH溶液溶解，将NAA用1ml无水乙醇预溶，待溶解完全后，分别用容量瓶定容至100ml，即得到0.1mg/ml的母液（实验时按需要量取）。
　3.1.2 完全培养基的制备
1. 取出母液并按添加顺序放好，将实验所需的量筒，移液枪，烧杯，移液管，吸耳球和玻璃棒等放在实验台上，以备实验所需。
2. 取一干净的烧杯，加入1/3左右（配制培养基总量的1/3左右）的蒸馏水，取大量元素母液150ml、微量元素母液15ml、铁盐母液15ml、机物母液7.5ml，上述溶液移入容量瓶中，加蒸馏水定容。
3. 将定容好的培养基倒入烧杯中，称取琼脂粉，倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热，直到琼脂粉完全熔化溶液透明。
4. 然后称取蔗糖45g搅拌溶解。
5. 初代培养基按1mg/L 6-BA 15微升、0.1mg/L NAA1.5微升。用移液枪精确量取所需激素母液，加入培养基中。
6. 用精密试纸或PH计调整pH至6.0。用配制好的0.1mol/L的HCl和0.1mol/L的NaOH溶液来调节pH值。
7. 稍微冷却后，分装入以洗净的三角培养瓶中。再用布塞和牛皮纸封口，最后用绳子扎紧。
8. 另取适量滤纸（多张/组）、培养皿（2套/组），用牛皮纸包好扎紧；另取去离子水适量装入盐水瓶,盖好塞子；另取小镊子和刀等包好（2套/组）。
9. 将步骤7、8所准备的物品统一放入高压锅内，120KPa灭菌30min左右。灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固，放入超净台备用。在开始操作前将所用器材放入超净台，打开紫外灯进行消毒。
3.2兰州百合外植体灭菌处理和初代培养
将买来的新鲜兰州百合的鳞茎拨开，洗去上面的泥土，在用流动的自来水冲洗2h，用前再用蒸馏水洗1-2遍放到4度冰箱保存待用。在超净工作台上采用75%的酒精溶液侵泡90s，去离子水水冲洗3次，然后用3%NaClO3溶液浸泡15min，用去离子水冲洗3次，进行外植体消毒处理。然后放在无菌滤纸上，用无菌刀切成0.5cm大小的小块，凹面向上，接种于培养基上。每人接种1瓶，每瓶接种3块外植体。培养条件： 25℃、湿度80%、光照8h/d、光照强度2000lx。每5天向培养箱中加一次水，每隔两天进行观察和记录生长情况，一周左右鳞片的颜色会发生变化，由刚开始的白色慢慢有点变紫色，培养10天左右鳞片由淡绿色慢慢变为绿色。

四、实验结果及讨论
4.1实验结果

图1：5月20日，第4天，生长正常，边缘变成浅黑色

图2、3：5月23日，第7天，无染菌现象，黑色边缘加深，表面有紫色纹路

图4:5月27日，第11天，表面紫色加深，有绿色出现

图5:5月30日，第14天，表面绿色加深，无染菌现象

图6：6月3日，第18天，和上次相比没有太大变化，无染菌现象

图7：6月6日，第21天，无太大变化，此时边缘变为深黑色

图8、9：6月14日，第29天，长出芽

图10：6月22日，第37天，芽变大

4.2讨论
在本次百合的植物组织培养实验中，我接种的锥形瓶中一次就成功长出了愈伤组织，且没有出现染菌现象。在接种后第十天左右，百合鳞茎表面出现绿色；第18天时观察到绿色加深；第29天时长出芽。总结实验成功原因如下：1、实验台、器材等灭菌彻底，无菌操作严格，包扎严密，因此没有杂菌污染；2、配制母液时各试剂用量严格控制，保证没有某些物质过多或过少影响百合生长；3、培养环境适宜；4、接种时用镊子动作要轻，防止破坏组织；5、在接种过程中控制百合鳞茎在酒精中的浸泡时间；6、选取较为强壮的百合鳞茎，切成适宜的大小。但是在培养过程中外植体生长速度较慢，可能是因为培养箱内湿度不够，接种时鳞茎凹面朝下。
通过本次实验，我认识到了无菌操作的重要性，并且在老师和学姐的悉心指导下，规范了操作动作，熟悉了实验步骤，积累了实战经验，为以后各学科的实验操作打下坚固基础。

本课程论文是在李硕老师和学姐的悉心指导下完成的，特此感谢！
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