微生物检验支原体及检验.doc

第二十九章　支原体及检验

本章考点：
1.概述
（1）概念
（2）分类与命名
（3）生物学特性
（4）微生物学检验
2.肺炎支原体
（1）生物学特性
（2）致病性
（3）微生物学检验
3.解脲脲原体
（1）生物学特性
（2）致病性
（3）微生物学检验
4.其他支原体
简介

　　一、概述
　　支原体是一类①无细胞壁，②呈高度多形态性，③能通过除菌滤器，在④人工培养基上能生长繁殖的⑤最小原核型微生物。
　　（一）分类与命名
　　支原体种类繁多，分布广泛。支原体科分为支原体和脲原体两个属。在支原体属中，对人有致病性的主要为肺炎支原体、人型支原体、生殖道支原体、穿透支原体等；而脲原体属中解脲脲原体（也称溶脲脲原体）对人致病。
　　（二）生物学特性
　　1.形态与结构：支原体个体微小，大小约0.2～0.3μm，呈高度多形态，有球形、杆形、分支丝状等。革兰染色为阴性，但不易着色，常用姬姆萨染色，呈淡紫色。
　　无细胞壁仅有细胞膜是与细菌区别的主要特点。支原体的细胞膜，有外、中、内三层所组成，内外两层主要为蛋白质，中间层系脂质，其中胆固醇类含量高。凡能作用于胆固醇的物质如两性霉素B、皂甙及毛地黄甙均可破坏细胞膜致其死亡。
　　2.培养特性：支原体大多数需氧或兼性厌氧，通常在含95%N2、5%C02环境中生长良好。营养要求较一般细菌高，可在含牛心浸液、马血清与酵母浸液的培养基上生长。支原体与脲原体对最适pH要求不同。支原体一般在pH7.8-8.0间生长，低于7.0则死亡。
　　支原体的菌落特征与细菌L型菌落极相似，37℃培养3～10天可形成直径为0.2～0.5mm大小的菌落，用低倍镜观察，菌落呈“荷包蛋”样，即中央部分较厚，不透明，向下长入培养基内，周边为一层薄薄的透明颗粒区。
　　支原体有许多特性与细菌L型相似，如多形性、可通过滤菌器、对低渗敏感、菌落呈“荷包蛋”样。两者不同点在于细菌L型在无抗生素等诱导因素作用下，易返祖为原菌，而支原体为独立的一类微生物，不出现返祖现象。
　　3.生化反应：常以发酵葡萄糖、水解精氨酸和尿素等生物学特性不同，作为初步鉴别支原体的依据。
支原体
葡萄糖
精氨酸
尿素
吸附红细胞
肺炎支原体
+
-
-
+
生殖道支原体
+
-
-
-
人型支原体
-
+
-
-
穿透支原体
+
+
-
+
解脲脲原体
-
-
+
-

　　4.抗原成分：支原体的抗原性主要来自细胞膜，其外层蛋白质是主要的型特异性抗原，具有免疫原性。生长抑制试验（GIT）和代谢抑制试验（MIT）利用针对此抗原的型特异性血清来抑制支原体在培养基上生长，可将支原体分成若干血清型。
　　5.抵抗力：支原体对热的抵抗力一般与细菌相似。45℃经15～30分钟或55℃经5～15分钟即告死亡。支原体耐冷，不耐干燥。支原体对一些化学物质比细菌敏感，容易被重金属盐类、石炭酸、来苏儿等化学消毒剂灭活。
　　支原体因无细胞壁，对渗透压敏感，对作用于细胞壁的抗生素，如青霉素、头孢菌素等不敏感，对抑制或影响蛋白合成的抗生素如四环素、红霉素等敏感。
　　（三）微生物检查
　　由于支原体无固定形态，染色结果不易与标本中的组织碎片等杂物区别，故取患者标本直接镜检对各种支原体的诊断意义不大。微生物学检验方法主要靠分离培养与血清学检查。

　　二、肺炎支原体
　　（一）生物学特性
　　菌体呈短细丝状。长约2～5μm，典型的形态类似酒瓶状。姬姆萨染色呈淡紫色。分离培养的最适pH为7.6～8.0。P1蛋白是肺炎支原体的主要特异性免疫原，是目前血清学诊断的主要抗原。
　　（二）致病性
　　肺炎支原体可从口腔、呼吸道分离到，主要通过飞沫传播，是人类原发性非典型性肺炎的主要病原体之一。儿童和青年易感，首先引起上呼吸道感染，然后下行感染。病理变化主要是间质性肺炎、急性细支气管炎。还可引起肺外并发症。
　　（三）微生物学检验
　　采集咽分泌物、痰、支气管分泌物、胸水等。
　　1.分离与鉴定：这是确诊支原体感染的可靠方法之一。常以牛心消化液为基础另加20%小牛血清及新鲜酵母浸液制成液体或固体培养基。初次分离生长缓慢，通常先将标本接种于液体培养基中增菌，1周后培养基指示剂颜色改变，液体清晰，可转种于固体平板培养基，在5%C02环境中培养，初次分离肺炎支原体需1～2周才长菌落。菌落常不出现“荷包蛋”样，需经数次传代后，菌落开始典型。肺炎支原体分离培养有时需20天或更长时间，对临床快速诊断意义不大。
　　支原体在固体培养基上长出典型菌落，以此可初步诊断，再进一步进行生化反应和血清学鉴定。生化反应如：
　　（1）葡萄糖、精氨酸、尿素分解试验：发酵葡萄糖产酸，不能利用精氨酸、尿素。
　　（2）氯化三苯基四氮唑（TTC）还原试验：使无色TTC还原为粉红色。
　　（3）生长抑制试验（GIT）和代谢抑制试验（MIT）。抗血清。
　　（4）红细胞吸附试验；肺炎支原体的菌落能发生红细胞吸附。
　　2.血清学试验
　　（1）特异性血清学试验（临床少用）
　　1）ELISA技术：敏感性和特异性高，可检测IgM和IgG抗体。利用ELISA捕获法，以抗P1蛋白单抗检测标本中的肺炎支原体P1蛋白。
　　2）补体结合试验：诊断肺炎支原体常用的血清学方法，一般血清滴度≥1：64～1：128为阳性，病程中恢复期和急性期双份血清至少效价有4倍增长，近期感染可能性越大。主要检测IgM抗体。初次感染时出现阳性，再次感染时常不出现阳性。
　　3）间接血细胞凝集试验：敏感度略高于补体结合试验，主要检测IgM抗体。
　　（2）非特异性血清学试验（辅助诊断）：
　　冷凝集试验：将患者的稀释血清与O型Rh阴性红细胞在4℃下作凝集试验。一般血清滴度≥1：64即为阳性，病程中双份血清至少效价有4倍增长，近期感染可能性越大。
　　3.PCR试验快速检测。

　　三、解脲脲原体
　　（一）生物学特性
　　解脲脲原体（Uu）在液体培养基中菌体以球形为主，直径约50～300nm。姬姆萨染色呈紫蓝色。生长最适pH为5.5～6.5，因其具有尿素酶分解培养基中的尿素产氨，使pH升高，可加速其死亡。解脲脲原体除脂多糖抗原和蛋白抗原外，还有脲酶抗原，后者是种特异性抗原。
　　（二）致病性
　　解脲脲原体是人类生殖道最常见的寄生菌之一，在特定的环境下可以致病。主要通过性行为传播，是非淋菌性尿道炎的主要病原体之一。若上行感染，还可引起男性和女性的其他泌尿生殖道炎症。另外解脲脲原体还可通过垂直传播，引起新生儿，特别是早产儿，呼吸道感染和中枢神经系统感染。
　　（三）微生物学检验
　　合理采集相应标本，如尿液、前列腺液、精液、阴道分泌物等。
　　1.诊断解脲脲原体感染，分离培养是相对容易和快速的。取标本少许接种于含酚红、尿素及血清的液体培养基内，最好在95%N2和5%C02环境中，37℃孵育，1～2天内即可出现生长现象。取培养物少许（约0.2ml左右）转种在相应的固体培养基上，培养48小时。
　　如出现典型菌落，则进行形态观察及生化试验，进行初步鉴定。解脲脲原体只分解尿素，不分解葡萄糖、精氨酸。进一步利用特异性血清作MIT和GIT试验进行最终鉴定。
　　2.核酸检测：以部分脲酶基因的核酸序列为模板，利用PCR方法扩增后的产物进行核酸杂交，鉴定解脲脲原体，其特点是快速、敏感、稳定、可靠。
　　3.解脲脲原体的血清学诊断意义不大，主要原因是有些无症状者也可有低效价的抗体。

　　四、其他支原体
　　人型支原体最常见的寄生部位是泌尿生殖道，多引起妇女泌尿生殖道感染，还能感染胎儿和在分娩时感染婴儿，造成新生儿感染和死胎。
　　穿通支原体、发酵支原体、梨形支原体被认为是加速AIDS进程的一个协同因子。
第二十八章　立克次体及检验

本章考点：
1.概述
立克次体共同特征与分类
2.生物学特性
（1）形态与染色
（2）抗原构造
（3）培养特性
3.致病性
概述
4.微生物学检验
（1）标本的采集
（2）直接检查
（3）分离培养
（4）血清学检测

　　一、概 述
　　立克次体是一类严格寄生在细胞内的原核细胞型微生物。
　　立克次体的共同特征：①大多是人畜共患病原体，引起人类发热和出血性疾病。②以节肢动物为传播媒介或储存宿主；③大小介于一般细菌与病毒之间，革兰染色阴性，呈多形性主要为球杆状；④除极少数外均专性活细胞内寄生；⑤对多种抗生素敏感。⑥菌体内同时含有DNA和RNA；⑦以二分裂方式进行繁殖。
　　对人类致病的立克次体有五个属：立克次体属、柯克斯体属、东方体属、埃立克体属和巴通体属。立克次体属分为2个生物型：斑疹伤寒群、斑点热群。原有的立克次体属恙虫病群已另立为东方体属，罗沙利马体并入巴通体属，柯克斯体属的生物型是Q热。

　　二、生物学特性
　　1.形态与结构：立克次体形似小杆菌，大小为（0.8～2.0）μm×（0.3～0.6）μm，具有程度不同的多形性。可出现球杆状，有时呈丝状，无鞭毛或荚膜。革兰染色阴性，但一般不易着色，常用Giemsa、Macchiavello和Giménez法染色，Giemsa染呈紫红色，常显两端浓染，Maechiavello染呈红色，Giménez法染呈红色，背景为绿色。
　　立克次体的结构与革兰阴性菌非常相似，脂类含量比细菌多，细胞壁弹性较大。
　　各种立克次体在细胞内存在部位有所不同，以此可作初步鉴别。
立克次体
定位
普氏立克次体
胞质中
恙虫病立克次体
胞质近核处
Q热立克次体
胞质的空泡中
斑点热立克次体
胞质外，核内
埃立克体
宿主细胞膜包被的空泡内

　　2.抗原组成构造：立克次体有两类特异性抗原：群特异性和种特异性。
　　①群特异性抗原是立克次体悬液经乙醚处理后获得的可溶性抗原。
　　②种特异性抗原，为颗粒性抗原。
　　斑疹伤寒等立克次体与变形杆菌某些X株的菌体抗原（OX19、0X2、OXK抗原）具有共同的耐热性多糖类属抗原，因而临床上常用后者代替相应的立克次体抗原进行非特异性凝集反应，作为人类或动物血清中有关抗体的检查。这种交叉凝集试验称为外斐反应，用于立克次体病的辅助诊断。
　　3.培养特性：除巴通体外，其他立克次体只能在活的真核细胞内生长。立克次体的分离繁殖常用方法有鸡胚卵黄囊培养、细胞培养。接种豚鼠等动物可用于立克次体的初代分离。汉赛巴通体接种新鲜巧克力平板，在35℃、5%CO2环境中培养2周左右才长出菌落。

　　三、致病性
　　立克次体病以发热、头痛、皮疹及中枢神经系统症状为其特征。发热多为稽留热，伴剧烈头痛、肌肉痛；可伴恶心、呕吐；皮疹可为充血性皮疹或出血性皮疹；严重时可累及中枢神经系统，出现神志不清、昏迷等症状。
立克次体
传播媒介
所致疾病
立克次体斑疹伤寒群
普氏立克次体
体虱
流行性斑疹伤寒
莫氏立克次体
鼠蚤或鼠虱
地方性斑疹伤寒
恙虫病立克次体
恙螨幼虫
恙虫病
贝纳柯克斯体（又称Q热立克次体）
蜱或通过接触、呼吸道、消化道等途径
Q热。以出现肺炎和肝炎为其临床特征
汉赛巴通体
猫抓伤、咬伤
杆菌性血管瘤-杆菌性紫癜和猫抓病

　　四、微生物学检验
　　由于立克次体的传染性较强，许多立克次体实验室均曾发生过实验室感染，因此每个实验室必须有专门培训过的技术人员，还要有严格隔离防护措施和各项操作制度。实验室工作者应首先接种疫苗，必要时进行药物预防，以防止实验室感染的发生。
　　（一）标本的采集和处理
　　1.病人血液：在发病初期或急性期较易检出病原体。在病程第一周内并在使用广谱抗生素前采集患者血液5～10ml，立即在患者床边接种于动物。血清学检查标本一般采集3份血液标本，分别取自病程早期、病后10～14天及病后21～28天。如患者已使用抗生素治疗，因抗体产生较晚，故需采集第4份标本。
　　2.活检或尸检材料：肺、肝、脾等组织标本研磨制成10%～20%悬液，低速离心取上清接种，若标本有细菌污染，可加青霉素（100～1000IU／ml）置室温作用30min后接种动物。
　　（二）标本直接检查
　　1.立克次体的染色法：多用于脏器标本的检查。标本印片、固定后用荧光抗体染色或常规染色镜检。必要时作切片检查。
　　2.核酸检测：针对特异性抗原基因的序列设计引物，采用PCR技术和核酸探针检测。
　　（三）立克次体培养法
　　1.立克次体分离：斑疹伤寒、斑点热、恙虫病和Q热病原体分离多用动物接种。常用动物有豚鼠、金黄地鼠、小白鼠、大白鼠及家兔等。汉赛巴通体用人工培养基，埃立克体用细胞培养。
　　2.分离株的大量繁殖及保存用鸡胚卵黄囊培养或细胞培养。
　　（四）血清学试验
　　血清学试验是研究立克次体的重要方法，也是立克次体病实验诊断和鉴定病原体的重要手段。病人双份血清的试验结果，有利于立克次体病现症诊断。
　　1.间接免疫荧光（IFA）试验、ELISA间接法是目前检测标本中特异性抗体的常用方法。间接微量免疫荧光技术的方法敏感，重复性好，又节省材料和时间，因而在血清学诊断及立克次体种别鉴定上广泛应用。
　　单份血清滴度≥1：128者有现症诊断意义，一般滴度在1：16或以上即为阳性，4倍增长可作为立克次体病的现症诊断。
　　2.凝集试验：分为特异性凝集和非特异性凝集试验两种，具体方法如下：
　　（1）特异性凝集试验：微量血凝试验（MA）、间接血凝试验（IHA）、乳胶凝集试验（LA）。MA以血清最高稀释度呈凝集者为其滴度，达1：8以上者为阳性。IHA滴度在1：50以上有诊断价值。LA结果与IHA结果相吻合。
　　（2）非特异性凝集试验：外斐试验常用于立克次体属的三个生物型的诊断，缺乏敏感性和特异性。本试验除Q热、立克次体痘及汉赛巴通体感染为阴性外，其他为阳性结果。表5-28-1为各种立克次体病与变形杆菌OX株抗原的交叉反应性。
　　一般血清滴度达1：160即为阳性，病程中双份或多份血清试验，至少效价有4倍增长才有诊断意义。
　　表5-28-1　外斐反应
疾病
变形杆菌抗原
OX19
OX2
OXK
流行性斑疹伤寒
++++
+
-
地方性斑疹伤寒
++++
+
-
斑点热
++++或+
+或+++
-
恙虫病
-
-
++++
腺热
-
-
++

　　3.血清学方法评价：见表5-28-2
　　表5-28-2　立克次体血清学检测方法及评价
方法
最低阳性效价
检出抗体时间
特点
外斐反应
>1:160
2～3周
缺乏敏感性及特异性，抗原易得，方法简便
IFA
1:16～64,Q热常≥1:128有现症诊断意义
2～3周
需用抗原少,群特异性,相当敏感,能区分Ig类别
ELISA
OD值0.25>对照
1周
IgM捕捉作早期诊断，使用于大批及微量标本
CF
1:8或1:16
2～3周
不及IFA或ELISA敏感，非常特异，方法繁琐
MA
≥1:8
1～2周
抗原纯度要求高，不如IFA敏感，比CF敏感
IHA
1:50
1～2周
很敏感，群特异性，只在感染活动期才能检出
LA
1:64
1～2周
晚期恢复期血清不敏感，群特异性

　　本章练习题：
　　流行性斑疹伤寒的病原体是
　　A.立氏立克次体
　　B.莫氏立克次体
　　C.康氏立克次体
　　D.普氏立克次体
　　E.斑疹伤寒立克次体
　　[答疑编号500735280101]
　　『正确答案』D
　　易使外-斐试验呈现假阳性的疾病是
　　A.伤寒
　　B.变形杆菌感染
　　C.立克次体病
　　D.痢疾
　　E.沙眼
　　[答疑编号500735280102]
　　『正确答案』B