酶的化学修饰公开课一等奖优质课大赛微课获奖课件.pptx
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1、退出 Enzyme Engineering酶工程第1页第1页第五章第五章 酶化学修饰酶化学修饰第一节第一节概述概述第二节第二节酶分子化学修饰办法学酶分子化学修饰办法学第三节第三节酶分子侧链基团化学修饰酶分子侧链基团化学修饰第四节第四节有机大分子对酶修饰有机大分子对酶修饰第五节金属离子置换修饰及物理修饰第五节金属离子置换修饰及物理修饰第六节第六节酶化学修饰应用酶化学修饰应用第2页第2页第一节第一节 概述概述 一、一、概念概念二、二、进行化学修饰原因进行化学修饰原因三、三、化学修饰基本原理化学修饰基本原理四、四、修饰酶特点修饰酶特点第3页第3页一、概念一、概念 n酶化学修饰酶化学修饰利用各种修饰剂
2、含有化学基团,与酶分子上某利用各种修饰剂含有化学基团,与酶分子上某种氨基酸残基产生化学反应,使酶分子结构发生改种氨基酸残基产生化学反应,使酶分子结构发生改变,从而改变酶一些特性和功效技术变,从而改变酶一些特性和功效技术n修饰酶修饰酶在体外用一定化学办法将酶和一些试剂进行共在体外用一定化学办法将酶和一些试剂进行共价连接后而形成酶价连接后而形成酶体外改造体外改造第4页第4页二、二、进行化学修饰原因进行化学修饰原因q稳定性不够,不能适应大量生产需要稳定性不够,不能适应大量生产需要q作用最适条件不符,活性不高作用最适条件不符,活性不高q临床应用特殊要求:也许含有抗原性临床应用特殊要求:也许含有抗原性第
3、5页第5页三、三、化学修饰基本原理化学修饰基本原理1、如何增强酶天然构象稳定性与耐热性、如何增强酶天然构象稳定性与耐热性2、如何保护酶活性部位与抗克制剂、如何保护酶活性部位与抗克制剂3、如何维持酶功效结构完整性与抗蛋白、如何维持酶功效结构完整性与抗蛋白水解酶水解酶4、如何消除酶抗原性及稳定酶微环境、如何消除酶抗原性及稳定酶微环境第6页第6页四、四、修饰酶特点修饰酶特点1、热稳定性增长、热稳定性增长2、增长抗克制剂、抗蛋白水解酶能力,体、增长抗克制剂、抗蛋白水解酶能力,体内半衰期延长内半衰期延长3、消除了酶抗原性、消除了酶抗原性4、微环境稳定性增强,最适、微环境稳定性增强,最适pH改变改变5、酶
4、学性质改变、酶学性质改变第7页第7页第一节结束第一节结束概念概念进行化学修饰进行化学修饰原因原因化学修饰基本化学修饰基本原理原理修饰酶特点修饰酶特点第8页第8页第一节结束第一节结束n点击返回 第9页第9页第二节第二节 酶分子化学修饰办法学酶分子化学修饰办法学 一、一、修饰需考虑问题修饰需考虑问题二、二、选择酶分子修饰剂选择酶分子修饰剂三、三、修饰反应普通程序修饰反应普通程序四、四、测定修饰程度和修饰部位测定修饰程度和修饰部位五、五、酶修饰办法酶修饰办法第10页第10页一、一、修饰需考虑问题修饰需考虑问题1、酶性质理解酶性质理解(1)酶活性部位情况酶活性部位情况(2)酶稳定条件、酶反应最适条件酶
5、稳定条件、酶反应最适条件(3)酶分子侧链基团化学性质及反应活酶分子侧链基团化学性质及反应活泼性等泼性等第11页第11页一、一、修饰需考虑问题修饰需考虑问题2、选择反应条件选择反应条件(1)反应体系中酶与修饰剂分子百分比反应体系中酶与修饰剂分子百分比(2)反应体系溶剂性质,反应体系溶剂性质,pH条件和离子强度条件和离子强度(3)反应温度及时间反应温度及时间(4)其它其它第12页第12页二、二、选择酶分子修饰剂选择酶分子修饰剂n修修饰剂须具具备特性特性1、能选择性地与一个氨基酸残基反应能选择性地与一个氨基酸残基反应2、反应在确保酶蛋白不变性条件下进行反应在确保酶蛋白不变性条件下进行3、被标识残基在
6、肽中稳定,容易通过降解分离被标识残基在肽中稳定,容易通过降解分离出来并鉴定出来并鉴定4、反应程度能用简朴技术测定反应程度能用简朴技术测定第13页第13页二、二、选择酶分子修饰剂选择酶分子修饰剂n修修饰剂选择1、修饰剂相对分子质量、修饰剂链长度对蛋修饰剂相对分子质量、修饰剂链长度对蛋白质吸附性白质吸附性2、修饰剂上反应基团数目及位置修饰剂上反应基团数目及位置3、修饰剂上反应基团活化办法与条件修饰剂上反应基团活化办法与条件第14页第14页三、三、修饰反应普通程序修饰反应普通程序修修饰反反应终止止稀稀释阳离子互阳离子互换洗洗涤过滤干燥干燥第15页第15页三、三、修饰反应普通程序修饰反应普通程序注意事
7、注意事项n修修饰后需后需进行总氨基酸分析进行总氨基酸分析n各种各种酶分子,修饰后均需对每个氨基酸残基酶分子,修饰后均需对每个氨基酸残基进行拟定进行拟定n注意缓冲液成份或修饰副产物对修饰部位和注意缓冲液成份或修饰副产物对修饰部位和修饰程度及对酶活性影响修饰程度及对酶活性影响n修饰后酶性质改变修饰后酶性质改变第16页第16页四、四、测定修饰程度和修饰部位测定修饰程度和修饰部位修饰反应评价原因1、有多少修饰剂已结合到酶分子上2、哪些氨基酸被修饰,修饰度是多少3、有多少种不同形式修饰剂酶分子耦合物,每种各有多少4、表面修饰、内部修饰 测定方法第17页第17页五、五、酶修饰办法酶修饰办法n侧链基团化学修
8、饰侧链基团化学修饰n大分子结合修饰大分子结合修饰n其它其它(金属离子置换修饰、物理修饰金属离子置换修饰、物理修饰)第18页第18页第二节结束第二节结束酶分子性质理解酶分子性质理解选择酶分子修饰剂选择酶分子修饰剂选择反应条件选择反应条件修饰反应要注意其它问题修饰反应要注意其它问题修饰反应普通程序修饰反应普通程序测定修饰程度和修饰部位测定修饰程度和修饰部位酶修饰办法酶修饰办法第19页第19页第二节结束第二节结束n点击返回 第20页第20页第三节第三节 酶分子侧链基团化学修饰酶分子侧链基团化学修饰 一、一、概述概述二、二、几种主要修饰反应几种主要修饰反应三、三、特定氨基酸残基侧链基团化学修饰特定氨基
9、酸残基侧链基团化学修饰第21页第21页一、一、概述概述n侧链基团修饰侧链基团修饰采用一定办法采用一定办法(普通为化学法普通为化学法)使酶分子侧使酶分子侧链基团发生改变,从而改变酶分子特性和功效链基团发生改变,从而改变酶分子特性和功效修饰办法修饰办法n酶侧链基团酶侧链基团构成蛋白质氨基酸残基上功效团。有氨基、构成蛋白质氨基酸残基上功效团。有氨基、羧基、巯基、咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、羧基、巯基、咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基等胍基、甲硫基等第22页第22页一、一、概述概述n作用作用研究各基团作用及其对酶结构、特性和功效研究各基团作用及其对酶结构、特性和功效影响影响(研究酶活性中心
10、必需基团研究酶活性中心必需基团)改变酶分子性质,提升实用价值改变酶分子性质,提升实用价值测定某一基团在酶分子中数量测定某一基团在酶分子中数量取得新酶种取得新酶种第23页第23页一、一、概述概述n类别类别蛋白类酶蛋白类酶核酸类酶核酸类酶侧链基团:磷酸基,核糖上羟基,嘌呤、嘧啶碱侧链基团:磷酸基,核糖上羟基,嘌呤、嘧啶碱基上氨基和羟基基上氨基和羟基(酮基酮基)等等第24页第24页二、二、几种主要修饰反应几种主要修饰反应q酰化及其相关反应酰化及其相关反应q烷基化反应烷基化反应q氧化还原反应氧化还原反应q芳香环取代反应芳香环取代反应第25页第25页酰化及其相关反应酰化及其相关反应第26页第26页烷基化
11、反应烷基化反应 第27页第27页氧化和还原反应氧化和还原反应 第28页第28页芳香环取代反应芳香环取代反应 定量测定定量测定第29页第29页三、三、特定氨基酸残基侧链基团化学修饰特定氨基酸残基侧链基团化学修饰n巯基巯基n氨基氨基n羧基羧基n咪唑基咪唑基n胍基胍基n二硫键二硫键第30页第30页1、巯基化学修饰巯基化学修饰 n巯基:许多酶活性中心催化基团;形成二硫巯基:许多酶活性中心催化基团;形成二硫键,稳定酶结构键,稳定酶结构n巯基含有很强亲核性,采用巯基修饰剂与酶蛋白巯基含有很强亲核性,采用巯基修饰剂与酶蛋白侧链上巯基结合,使巯基发生改变,从而改变酶侧链上巯基结合,使巯基发生改变,从而改变酶空
12、间构象、特性和功效。提升酶稳定性空间构象、特性和功效。提升酶稳定性n惯用:酰化基、烷基化剂、马来酰亚胺、二硫苏惯用:酰化基、烷基化剂、马来酰亚胺、二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐、硼氢化钠糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐、硼氢化钠第31页第31页第32页第32页2、氨基化学修饰氨基化学修饰 n氨基甲基化与乙酰化氨基甲基化与乙酰化赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酰胺侧链氨基;谷赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酰胺侧链氨基;谷氨酰胺和天冬氨酸羧基氨酰胺和天冬氨酸羧基-OH上上甲基转移酶甲基转移酶n氨基烷基化氨基烷基化脱氨基作用或与氨基共价结合,屏蔽酶分子侧链上脱氨基作用或与氨基共价结合,屏蔽酶分子侧链上氨基氨基
13、修饰剂:亚硝酸、修饰剂:亚硝酸、2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯(DNFB)、丹磺酰氯、丹磺酰氯(DNS)、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亚胺甲酯、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亚胺甲酯第33页第33页第34页第34页3、羧基化学修饰、羧基化学修饰 n修饰剂与酶分子侧链羧基进行酯化、酰基化等反修饰剂与酶分子侧链羧基进行酯化、酰基化等反应应n修饰剂:碳化二亚胺、重氮基乙酸盐、乙醇修饰剂:碳化二亚胺、重氮基乙酸盐、乙醇-盐盐酸试剂、异噁唑盐等酸试剂、异噁唑盐等第35页第35页第36页第36页4、咪唑基化学修饰咪唑基化学修饰 n组氨酸。许多酶活性中心必需基团组氨酸。许多酶活性中心必需基团n修饰剂通过咪唑
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