微生物检验肠杆菌科及检验.doc
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1、第十九章肠杆菌科及检验本章考点:1.概述(1)概念(2)命名与分类原则(3)共同特点(4)自然与人体内的分布(5)微生物学检查方法(6)临床意义2.埃希菌属、沙门菌属、志贺菌属、变形杆菌属、耶尔森菌属(1)生物学性状(2)微生物学检查法(3)临床意义一、概述和通性(一)概念肠杆菌科是由多个菌属组成,其生物学性状相似,均为革兰阴性杆菌。大多数肠道杆菌属于正常菌群,作为条件致病菌而引起疾病。其中包括常引起腹泻和肠道感染的细菌(埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、耶尔森菌属)和常导致院内感染的细菌(枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、多源菌属、沙雷菌属、变形杆菌属、普罗威登菌属和摩根菌属),以及一些在一定
2、条件下偶可引起临床感染的细菌。(二)分类根据伯杰系统细菌学手册(1984年)将肠杆菌科的细菌分为20个属即埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属、哈夫尼亚菌属、爱德华菌属、普罗威登斯菌属、变形杆菌属、摩根菌屑、耶尔森菌属等。(三)生物学特性1.形态与染色革兰阴性杆菌,其菌体大小为(1.06.0)m(0.31.0) m。多数有周鞭毛,除外志贺菌属、克雷伯菌属、鼠疫耶尔森菌和EIEC无鞭毛。均不形成芽胞,少数菌属细菌可形成荚膜。2.培养:需氧或兼性厌氧,营养要求不高,在普通琼脂培养基和麦康凯培养基上均能生长并形成中等大小的S型菌落,液体培养基中呈混浊生长。3.生
3、化反应:发酵葡萄糖产酸、产气, 乳糖发酵试验: 肠道非致病菌(),肠道致病菌()(除外变形杆菌)。肠杆菌科定科试验主要项目是革兰阴性杆菌、触酶阳性,氧化酶阴性,硝酸盐还原试验阳性。4.抗原构造:包括菌体(O)抗原,鞭毛(H)抗原和表面抗原(如Vi抗原、K抗原)3种。5.变异:包括菌落SR变异,鞭毛HO变异和耐药性或生化反应性质的改变。6。抵抗力:不强。加热60,30分钟即被杀死。不耐干燥,对一般化学消毒剂敏感。对低温有耐受力,能耐胆盐。(四)致病性肠杆菌科细菌种类多,可引起多种疾病:1.致病性肠道杆菌:以肠内感染为主,腹泻为共显症状,引起急慢性肠道感染、食物中毒、旅游者腹泻及肠热症等。2.条件
4、致病菌:为医院感染主要病原菌,出现移位感染。(五)微生物学检验1.分离培养:将粪便或肛拭标本立即接种在肠道菌选择培养基上或先增菌后再分离;血、尿或脓汁等其他标本原则上不使用选择培养基。分离纯菌后,根据菌落特点,结合革兰染色及氧化酶反应结果作进一步鉴定。2.鉴定(1)初步鉴定:原则是:确定肠杆菌科的细菌,应采用葡萄糖氧化-发酵试验及氧化酶试验与弧菌科和非发酵菌加以鉴别;肠杆菌科细菌的分群,多采用苯丙氨酸脱氨酶和葡萄糖酸盐试验,将肠杆菌科的细菌分为苯丙氨酸脱氨酶阳性、葡萄糖酸盐利用试验阳性和两者均为阴性反应三个类群;选择生化反应进行属种鉴别。表5-19-1肠杆菌科的初步分类菌属名苯丙氨酸葡萄糖酸盐
5、变形杆菌属 普罗威登斯菌属 摩根菌属 克雷伯菌属肠杆菌属* *沙雷菌属哈夫尼亚菌属埃希菌属志贺菌属沙门菌属枸橼酸杆菌属爱德华菌属耶尔森菌属*有例外将选择培养基或鉴别培养基上的可疑菌落分别接种克氏双糖铁琼脂(KIA)和尿素-靛基质-动力(MIU)复合培养基管中,并根据其六项反应结果,将细菌初步定属。(2)最后鉴定:肠杆菌科各属细菌的最后鉴定是根据生化反应的结果定属、种,或再用诊断血清做凝集反应才能作出最后判断。二、埃希菌属(一)概念埃希菌属包括5个种,即大肠埃希菌、蟑螂埃希菌、弗格森埃希菌、赫尔曼埃希菌和伤口埃希菌。临床最常见的是大肠埃希菌。大肠埃希菌俗称大肠杆菌,大多数菌株是人类和动物肠道正常
6、菌群。(二)生物学特性(性状)1.形态与染色:为革兰阴性短杆菌,(1.03.0)m(0.40.7)m。多数有周鞭毛,能运动。有菌毛、荚膜及微荚膜。2.培养特性:兼性厌氧菌,营养要求不高,在普通营养肉汤中呈浑浊生长。普通营养琼脂上呈灰白色的光滑型菌落。血琼脂平板上,少数菌株产生溶血环。在伊红美蓝琼脂上,由于发酵乳糖,菌落呈蓝紫色并有金属光泽。麦康凯和SS琼脂中的胆盐对其有抑制作用,耐受菌株能生长并形成粉红色菌落。3.生化反应:吲哚、甲基红、V-P、枸橼酸盐试验(IMViC试验)为+-(肠杆菌属多为-+)。克氏双糖铁琼脂(KIA)上斜面和底层均产酸产气,H2S阴性。动力、吲哚、尿素(MIU)培养基
7、的生化反应为+-。4.抗原结构:大肠埃希菌的抗原由菌体抗原(O)、表面抗原(K)和鞭毛抗原(H)三种构成。现已知有171种O抗原,100种K抗原和56种H抗原。一个菌株的抗原类型由特殊的0、K和H抗原的代码表示,其血清型别的方式是按0:K:H排列,例如0111:K58(B4):H2。(二)致病性主要是侵袭力、内毒素、肠毒素等致病因素引起各种炎症(如胆囊炎、泌尿系感染、肺炎、新生儿脑膜炎、伤口感染、菌血症及腹泻等)。内毒素还可引起发热、休克、DIC等。1.肠道外感染:主要由正常菌群条件致病,以泌尿系统感染常见,高位严重尿道感染与特殊血清型大肠埃希菌有关。如菌血症、胆囊炎、腹腔内脓肿。2.肠道感染
8、:致病性大肠埃希菌有下列五个病原群。(1)肠产毒型大肠埃希菌(ETEC):引起霍乱样肠毒素腹泻(水样泻)。(2)肠致病型大肠埃希菌(EPEC):主要引起婴儿腹泻。(3)肠侵袭型大肠埃希菌(EIEC):可侵入结肠黏膜上皮,引起志贺样腹泻(能产生粘液脓血便)。(4)肠出血型大肠埃希菌(EHEC):又称产志贺样毒素(VT)大肠埃希菌(SLTEC或UTEC),其中O157:H7可引起出血性大肠炎和溶血性尿毒综合征(HUS)。临床特征为严重的腹痛、痉挛,反复出血性腹泻,伴发热、呕吐等。严重者可发展为急性肾衰竭。(5)肠粘附(集聚)型大肠埃希菌(EAggEC):也是新近报道的一种能引起腹泻的大肠埃希菌。3
9、.CDC将大肠埃希氏菌O157:H7列为常规检测项目EHEC的血清型50种,最具代表性的是O157:H7。在北美许多地区,O157:H7占肠道分离病原菌的第二或第三位,是从血便中分离到的最常见的病原菌,分离率占血便的40%,6、7、8三个月O157:H7感染的发生率最高。且0157是4岁以下儿童急性肾功衰的主要病原菌,所以CDC提出应将大肠埃希氏菌0157:H7列为常规检测项目。(三)微生物学检验1.标本采集:肠道感染可采集粪便;肠道外感染可根据临床感染情况采集中段尿液、血液、脓汁、胆汁、脑脊液、痰、分泌液等。2.检验方法及鉴定(1)涂片与镜检:脓汁及增菌培养物发现单一革兰阴性杆菌,可初步报告
10、染色、形态、性状供临床用药参考。(2)分离培养:粪便标本可用弱选择鉴别培养基进行分离,脓汁等可用血平板分离,取可疑菌落进行形态观察及生化反应。(3)鉴定1)初步鉴定:根据菌落特征,涂片染色的菌形及染色反应,取纯培养物作生化反应。凡符合KIA:AA或KA、产气或不产气、H2S-;MIU:动力+或-、吲哚+、脲酶-;氧化酶-,IMViC:+-,可鉴定为大肠埃希菌。2)致病性大肠埃希菌:EPEC的鉴定:EIEC的鉴定:应与志贺菌相鉴别,两者的主要鉴别试验可用醋酸钠和葡萄糖铵利用试验及粘质酸盐产酸三种试验。大肠埃希菌均为阳性,而志贺菌均为阴性。ETEC毒素的检测:采用改良Elek法测定LT并采用乳鼠胃
11、内灌注法检测ST。EHEC的血清学鉴定:EAEC的鉴定:检测细菌对HEP-2细胞或Hela细胞的粘附性。肠道外感染,经涂片染色,分离培养后,生化鉴定到种;由于大肠埃希菌是超广谱-内酰胺酶(ESBLs)的主要产酶株,该酶由质粒介导。对ESBLs产酶株所致感染需要采用碳青酶烯类或内酰胺类抗生素酶抑制剂或头霉菌素类进行治疗。肠道内感染还需做血清分型、毒素测定或毒力试验。食物、饮料、水等卫生细菌学检查,主要进行大肠菌群指数检测。三、志贺菌属志贺菌属是人类细菌性痢疾最常见的病原菌,通称痢疾杆菌。根据生化反应与血清学试验该属细菌分为痢疾、福氏、鲍氏和宋内志贺菌四群。CDC分类系统(1989)将生化性状相近
12、的A、B、C群归为一群,统称为A、B、C血清群,将鸟氨酸脱羧酶和-半乳糖苷酶均阳性的宋内志贺菌单列出来。我国以福氏和宋内志贺菌引起的菌痢-最为常见。(一)生物学特性1.形态与染色:革兰阴性短小杆菌,(23)m(0.50.7)m,无荚膜,无芽胞,无鞭毛,有菌毛。2.培养特性:需氧或兼性厌氧,液体培养基中呈浑浊生长,在普通琼脂平板和SS培养基上形成中等大小、半透明的光滑型菌落,宋内志贺菌可形成扁平、粗糙的菌落。3.生化反应:志贺菌属的细菌KIA:KA、产气-+、H2S-,MIU:动力-、吲哚+-、尿酶-,氧化酶-,不产生赖氨酸脱羧酶,氧化酶试验阴性。4.抗原结构:志贺菌属只有O抗原而无鞭毛抗原,个
13、别菌型及新分离菌株有K抗原。(二)致病性致病物质:侵袭力:菌毛粘附于肠粘膜上皮细胞,诱导细胞内吞。内毒素:破坏肠粘膜;肠壁通透性;肠壁植物神经腹痛,腹泻,里急后重,粘液脓血便。外毒素(志贺毒素,ST):肠毒素活性;细胞毒活性;神经毒活性所致疾病:细菌性痢疾,简称菌痢。1.急性菌痢。2.中毒性菌痢。3.慢性菌痢。传染源为病人和带菌者,经粪口传播。(三)微生物学检验1.标本采集尽可能在发病早期及治疗前采集新鲜粪便,选择脓血便或粘液便,必要时可用肛拭子采集。2.检验方法及鉴定(1)分离培养:取粪便(粘液或脓血部分)或肛拭标本接种GN肉汤增菌及再进行分离培养。一般同时接种强弱选择性不同的两个平板。强选
14、择鉴别培养基可用沙门、志贺菌选择培养基(SS);弱选择培养基可用麦康凯或中国蓝培养基。培养1824h后选取可疑菌落进行下列鉴定。(2)鉴定1)初步鉴定:挑选可疑菌落34个先用志贺菌属多价诊断血清作试探性玻片凝集试验。将试探性凝集试验阳性的菌落至少接种23支KIA和MIU,经35 培养1824h,凡符合KIA:KA、产气-+、H2S-,MIU:动力-、吲哚+-、尿酶-,并结合试探性玻片凝集试验阳性结果可鉴定为志贺菌属。2)最后鉴定3.与类志贺邻单胞菌和伤寒沙门菌的鉴别:可用动力和氧化酶试验加以鉴别,志贺菌均为阴性,而类志贺邻单胞菌为阳性。伤寒沙门菌硫化氢和动力阳性,能与沙门菌属因子血清(0多价A
15、-F群或Vi)凝集而不与志贺菌属因子血清凝集。(四)防治原则人工主动免疫用于预防目前尚不理想,治疗细菌性痢疾一般首选氟喹诺酮类抗生素。四、沙门菌属(一)生物学特性1.形态与染色:本属菌为(0.71.5)m(2.05.0)m,无芽胞,无荚膜的革兰阴性直杆菌。除鸡沙门菌外都有周身鞭毛,能运动,多数有菌毛。2.培养特性:营养要求不高,在普通琼脂培养上即能生长,在液体培养基中呈均匀混浊。在SS琼脂和麦康凯琼脂培养基上3537 24h可形成直径约24mm的透明或半透明菌落,对胆盐耐受。产H2S者在SS琼脂上形成黑色中心。3.生化反应:除亚利桑那菌外均不能发酵乳糖,大多数IMViC试验为-+-+,KIA:
16、KA、产气+-、H2S+-,MIU:动力+、吲哚-、脲酶+。4.抗原结构:主要由0抗原和H抗原组成,部分菌株有类似大肠杆菌K抗原的表面抗原,与细菌的毒力有关,故称Vi抗原。(1)0抗原:即菌体抗原。沙门菌属的菌体抗原有58种,以阿拉伯数字依次标记:根据沙门菌有共同的O抗原这一特点,分类学者将有共同抗原的细菌归为一组,这就使沙门菌分成42个群(或组)。即A、B、CZ和O16O67群。每群都有群特异性抗原,如A群O2、B群04、D群O9等。(2)H抗原:即鞭毛抗原。H抗原是定型的依据。沙门菌H抗原有两相,第一相为特异性抗原,用a、b、c表示;第二相为共同抗原,用1、2、3表示。(3)表面抗原:已证
17、实沙门菌属有Vi、M和5抗原三种。Vi抗原加热6030min或经石炭酸处理被破坏,其存在时可阻止0抗原与相应抗体发生凝集。 5.变异性(1)SR变异,菌落光滑型经人工培养传代后逐渐变成粗糙型。此时菌体表面的特异多糖抗原丧失,在生理盐水中可出现自凝。(2)HO变异,指有鞭毛的沙门菌失去鞭毛的变异。(3)相位变异,具有双相H抗原(第相为特异相,第相为非特异相)的沙门菌变成只有其中某一相H抗原的单相菌,称相位变异。(4)VW变异,失去全部Vi抗原的变异。(二)致病性致病因素有侵袭力、内毒素和肠毒素3种。临床上可引起胃肠炎、肠热症、菌血症或败血症等。其中肠热症属法定传染病。1.肠热症:即伤寒与副伤寒病
18、。由伤寒与副伤寒沙门菌所引起的慢性发热症状。为法定传染病之一。2.食物中毒:引起食物中毒的沙门菌以鼠伤寒、肠炎、汤卜逊、猪霍乱、乙型及丙型副伤寒沙门菌为常见。3.慢性肠炎:沙门菌可引起老人和儿童的慢性肠炎。4.败血症:多由猪霍乱沙门菌引起。5.沙门菌的局部感染如颈部、腰部等。有鼠伤寒沙门菌引起儿童的医院感染报道。(三)微生物学检查1.标本采集:根据不同疾病采取不同的标本进行分离与培养。肠热症的第一、二周采血液,第二、三周采粪便与尿液。整个病程中骨髓分离细菌阳性率较高。食物中毒采集食物与粪便。2.检查方法及鉴定(1)分离培养1)粪便:一般将粪便或肛拭直接接种于SS和麦康凯平板上,用两种培养基的目
19、的是为提高标本的阳性检出率。2)血液和骨髓:抽取患者血液5ml或骨髓0.5ml,立即接种于含0.5%胆盐肉汤或葡萄糖肉汤5ml试管中进行增菌,48h将培养物移种到血平板和肠道鉴别培养基上,若有细菌生长取菌涂片革兰染色并报告结果。对增菌培养物连续培养7天,仍无细菌生长时,则报告阴性。3)尿液:取尿液23ml经硫磺酸盐肉汤增菌后,再接种于肠道菌选择培养基或血平板上进行分离培养,亦可将尿液离心沉淀物分离培养。4)局部感染的脓液。(2)鉴定:沙门菌属的鉴定与志贺菌属相同,须根据生化反应和血清学鉴定两方面进行。1)初步鉴定:如为革兰阴性杆菌时作氧化酶试验,阴性时,挑取可疑菌落分别移种于KIA和MIU上。
20、并作生化反应。以沙门菌多价诊断血清作玻片凝集试验。凡符合KIA:KA、产气+-、H2S+-、MIU:动力+、吲哚-、脲酶+,氧化酶-,触酶+,硝酸盐还原+,以沙门菌多价血清作玻片凝集试验阳性,鉴定为沙门菌属。2)最后鉴定:沙门菌血清学鉴定主要借助于沙门菌O抗原多价血清与O、H、Vi抗原的单价因子血清。甲型副伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌和伤寒沙门菌分别属于A、B、D血清群。(3)血清学诊断:肥达试验:用已知的伤寒沙门菌0、H抗原,甲乙丙副伤寒沙门菌H抗原稀释后与被检血清作定量凝集试验,以检测患者血清中抗体的含量,来判断机体是否受沙门菌感染而导致肠热症并判别沙门菌的种类。(四)防治原则加强饮食卫生,防
21、止污染食品及水源经口感染,携带者的积极治疗,皮下注射死菌苗或口服减毒活菌苗是预防沙门菌属细菌传染的几个主要措施。临床治疗是根据体外药敏试验结果选用合适抗生素,保持水及电解质的平衡,对并发症积极处理,如肠出血、肠穿孔、胆囊炎、心肌炎等。对于伤寒沙门菌感染,可选择的抗生素有氯霉素、氟喹诺酮类、氨苄西林、复方新诺明、三代头孢等。五、变形杆菌属、普罗威登斯菌属及摩根菌属变形杆菌属包括四个种,即普通变形杆菌、奇异变形杆菌、产粘变形杆菌和潘氏变性杆菌。普罗威登斯菌属有四个种:即产碱普罗威登斯菌、斯氏普罗威登斯菌、雷极普罗威登斯菌和P.rustigianii。摩根菌属只有一个种,即摩根摩根菌。这三个属的细菌
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