15新型PCR检测技术解析.pptx
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1、第第15讲讲新新型型PCR检测技技术回顾上节课所学回顾上节课所学PCR五个要素五个要素模板:单链或双链模板:单链或双链DNA引物:引物:16-30 bp合成的寡合成的寡核苷酸核苷酸DNA聚合酶:耐热的聚合酶:耐热的Taq底物:四种脱氧三磷酸核底物:四种脱氧三磷酸核苷苷(dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)液态反应体系:其中液态反应体系:其中Mg2+是是DNA聚合酶的激聚合酶的激活剂活剂基本程序基本程序94 30s 变性50-60 30-1 复性(使引物与模板充分退火)72 n(按1扩增1kb计算)延伸 25-35个循环基本内容基本内容一、多重一、多重PCRPCR二、二、荧光定量荧
2、光定量PCRPCR的原理的原理三、三、实时实时荧光定量荧光定量PCRPCR的原理的原理四、四、实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR与常规的与常规的PCRPCR的差别的差别五、实时荧光定量五、实时荧光定量PCRPCR的应用的应用六、课堂小结六、课堂小结七、作业七、作业一、一、多重多重PCR1、定定义:它是在同一它是在同一PCR反反应体系里加上体系里加上二二对以上引物以上引物,同,同时扩增出多个核酸片段增出多个核酸片段的的PCR反反应,其反,其反应原理,反原理,反应试剂和操作和操作过程与程与一般一般PCR相同相同。区别在多对引物需要设计。区别在多对引物需要设计。2、多重多重PCR的的步步骤:多重多
3、重PCR扩增区域的增区域的选择。多对多对引物的引物的设计。反反应条件的条件的选择及反及反应体系的体系的优化(化(引物引物浓度、模板度、模板浓度、度、dNTP及及酶的的浓度、度、Mg2+浓度、加入度、加入DMSO、甘油或者、甘油或者BSA、PCR循循环参数的参数的设定定)。结果分析果分析一、多重一、多重PCR一、多重一、多重PCR3 3、多重、多重PCRPCR的特点的特点高效性高效性 在同一在同一PCRPCR反应管内同时检出多种病原微生物,或对有反应管内同时检出多种病原微生物,或对有多个型别的目的基因进行分型,特别是用一滴血就可检测多个型别的目的基因进行分型,特别是用一滴血就可检测多种病原体。多
4、种病原体。系统性系统性 多重多重PCRPCR很适宜于成组病原体的检测,如肝炎病毒,肠很适宜于成组病原体的检测,如肝炎病毒,肠道致病性细菌,性病,无芽胞厌氧菌,战伤感染细菌及细道致病性细菌,性病,无芽胞厌氧菌,战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检。菌战剂的同时侦检。经济简便性经济简便性 多种病原体在同一反应管内同时检出,将大大的节省多种病原体在同一反应管内同时检出,将大大的节省时间,节省试剂,节约经费开支,为临床提供更多更准确时间,节省试剂,节约经费开支,为临床提供更多更准确的诊断信息。的诊断信息。一、多重一、多重PCR4、多重、多重PCR的的应用用(5个实例)个实例)例一例一 肝炎病毒的感染,在同
5、一病人体内,有肝炎病毒的感染,在同一病人体内,有时存在多种肝炎病毒重叠感染存在多种肝炎病毒重叠感染。有有时是甲是甲乙丙型肝炎病毒重叠乙丙型肝炎病毒重叠;有有时可能是甲乙型肝可能是甲乙型肝炎病毒重叠炎病毒重叠;有有时是乙丙型肝炎病毒重叠是乙丙型肝炎病毒重叠.一、多重一、多重PCR4、多重、多重PCR的的应用用(5个实例)个实例)例二例二 肠道致病性道致病性细菌的菌的检测,如,如伤寒,痢疾寒,痢疾和霍乱,有和霍乱,有时具有具有较相同的相同的肠道症状道症状,有,有时痢疾霍乱同存一病人并同痢疾霍乱同存一病人并同时发病病.一、多重一、多重PCR4、多重、多重PCR的的应用用(5个实例)个实例)例三例三
6、性病的性病的检测,如梅毒,淋病及艾滋病的,如梅毒,淋病及艾滋病的诊断断.战伤细菌及生物菌及生物战剂细菌的菌的检测,如破,如破伤风杆菌,杆菌,产气气荚膜杆菌,炭疽杆菌,鼠疫膜杆菌,炭疽杆菌,鼠疫杆菌等杆菌等侦检.需特殊培养的无芽胞需特殊培养的无芽胞厌氧菌,氧菌,如脆弱如脆弱类杆菌、杆菌、艰难杆菌的杆菌的鉴定等定等.一、多重一、多重PCR4、多重、多重PCR的的应用用(5个实例)个实例)例四例四 某些某些遗传病及癌基因的分型病及癌基因的分型鉴定定。遗传遗传病或癌基因,型病或癌基因,型别较多,或突多,或突变或缺失存在或缺失存在多个好多个好发部位部位,通,通过常常规PCR很很难检测出出来。来。例五例五
7、 植物种质鉴定、植物病毒的检测、分子植物种质鉴定、植物病毒的检测、分子育种、快速检测外源基因的整合状态。育种、快速检测外源基因的整合状态。一、多重一、多重PCR二、二、荧光定量光定量PCR的原理的原理 荧光定量荧光定量PCRPCR技术不仅实现了技术不仅实现了PCRPCR从从定性定性到到定量定量的飞跃,而且与的飞跃,而且与常规常规PCRPCR相比,它具有相比,它具有特异性更强、特异性更强、有效解决有效解决PCRPCR污染问题、自动化程污染问题、自动化程度高度高等特点,目前已得到广泛应用。等特点,目前已得到广泛应用。二、二、荧光定量光定量PCR的原理的原理荧光定量荧光定量PCRPCR最常最常用于用
8、于基因表达产物基因表达产物的分析,即将转录的分析,即将转录生成的生成的单链单链mRNAmRNA逆逆转录成转录成双链的双链的cDNAcDNA,以此以此cDNAcDNA为为模板进行反应。模板进行反应。(动画动画)荧光定量荧光定量PCRPCR所使用的荧光化学可分为两种:所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针荧光探针和和荧光染料荧光染料。1、荧光探光探针 PCR PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性特异性的的荧荧光探针光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧报告荧光基团光基团和一个和一个淬灭荧光基团淬灭荧光基团。
9、探针完整时,报告基团发射。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;的荧光信号被淬灭基团吸收;PCRPCR扩增时,扩增时,TaqTaq酶的酶的5533外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩每扩增一条增一条DNADNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与累积与PCRPCR产物形成完全同步。产物形成完全同步。荧光信号的强弱与荧光信号的强弱与PCRPCR的产物数量成正比,根据测量到的
10、产物数量成正比,根据测量到的荧光信号强弱,通过的荧光信号强弱,通过分析软件分析软件得到样本的原始拷贝数。得到样本的原始拷贝数。二、荧光定量二、荧光定量PCR的原理的原理1、荧光探光探针 二、荧光定量二、荧光定量PCR的原理的原理1、荧光探光探针 二、荧光定量二、荧光定量PCR的原理的原理1、荧光探光探针 二、荧光定量二、荧光定量PCR的原理的原理1、荧光探光探针 二、荧光定量二、荧光定量PCR的原理的原理1、荧光探光探针 二、荧光定量二、荧光定量PCR的原理的原理 2 2、荧光染料、荧光染料 在在PCRPCR反应体系中,加入反应体系中,加入过量荧光染料过量荧光染料,荧光染料特异性地掺入荧光染料
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