细菌和链霉菌的分子克隆载体.pptx

第四节细菌和链霉菌的分子克隆载体细菌和链霉菌的分子克隆载体一、革兰氏阴性菌克隆载体一、革兰氏阴性菌克隆载体1.移动载体（移动载体（mobilizablevector）1)特点特点i.广谱宿主范围，即复制子和遗传标记具很宽适应范广谱宿主范围，即复制子和遗传标记具很宽适应范围围ii.DNA的转移常常需要经过中间宿主细胞和借助于的转移常常需要经过中间宿主细胞和借助于辅助质粒，辅助质粒，DNA进入中间宿主细胞可用直接转化进入中间宿主细胞可用直接转化2)结构结构i.RK2质粒的结构质粒的结构a.oriVDNA复制起点复制起点b.DNA复制基因复制基因c.DNA转移基因转移基因d.oriTDNA转移基因转移基因e.药物抗性基因（药物抗性基因（AprKanrTcr）G+菌菌的的质质粒粒和和载载体体.移动载体与辅助质粒移动载体与辅助质粒pRK2013:将将RK2中的全部转移基因和中的全部转移基因和Kanr基因插入到基因插入到E.coli的的colE1质粒中构成辅助质粒质粒中构成辅助质粒pRK290:余下部分（余下部分（Apr除外）构成移动载体（约除外）构成移动载体（约20Kb）*当选用当选用E.coli为中间宿主时，必须先将为中间宿主时，必须先将pRK290经过直接经过直接转化引入转化引入E.coli（pRK2013也应转入同一细胞）。当要转移也应转入同一细胞）。当要转移pRK290时，只需将时，只需将E.coli细胞与其他细胞与其他G细胞混合，在细胞混合，在pRK2013的作用下，的作用下，pRK290可可接合转移接合转移至终宿主细胞。至终宿主细胞。3)不相容群不相容群（incompatibilitiygroup）克隆载体）克隆载体.P群：群：RP4RK2RP1R682-5拷贝拷贝.Q群：群：R300BRSF1010R116215-20拷贝拷贝.W群：群：Sa2-5拷贝拷贝4）遗传标记基因遗传标记基因大多数为抗生素标记基因，要注意不同大多数为抗生素标记基因，要注意不同G菌中的表达活性菌中的表达活性G-细菌中重组质粒的转移细菌中重组质粒的转移2.非移动载体非移动载体(non-mobilizablevector)1)特点特点：不能接合转移，但可经过直接转化进入那些可形不能接合转移，但可经过直接转化进入那些可形成感受态的细菌，具有广谱和窄谱两大类载体成感受态的细菌，具有广谱和窄谱两大类载体2)实例实例：P4D0105-由由E.coli噬菌体噬菌体P4构建而成，适合于构建而成，适合于E.coli和肺炎克蕾伯氏菌。和肺炎克蕾伯氏菌。.当辅助噬菌体提供当辅助噬菌体提供P4整合酶时，该载体可整合到整合酶时，该载体可整合到E.coli染色体中，整合入肺炎克蕾伯氏菌染色体则与整合酶无染色体中，整合入肺炎克蕾伯氏菌染色体则与整合酶无关。关。.该载体含有一个该载体含有一个virl突变和在引物酶基因突变和在引物酶基因中存在一个中存在一个琥珀突变琥珀突变(am52)，在无抑制子突变的菌株中，该载体不，在无抑制子突变的菌株中，该载体不能自主复制，但在有抑制子突变的菌株中能自主复制，但在有抑制子突变的菌株中(琥珀抑制子琥珀抑制子突变体），该载体则可自主复制。突变体），该载体则可自主复制。P4D0105载体的结构载体的结构二、革兰氏阳性菌（二、革兰氏阳性菌（G+）克隆载体）克隆载体1.枯草杆菌克隆载体枯草杆菌克隆载体1）B.subtilis作为宿主菌的优点作为宿主菌的优点.芽孢形成过程可用于阐明细胞发育过程芽孢形成过程可用于阐明细胞发育过程.遗传背景较清楚，可直接导入外源遗传背景较清楚，可直接导入外源DNA.非致病细菌，因而安全非致病细菌，因而安全.研究结果可用于其它芽孢杆菌研究结果可用于其它芽孢杆菌.存在各种分泌蛋白质存在各种分泌蛋白质2）B.subtilis作为宿主菌的缺点作为宿主菌的缺点.存在多种蛋白酶基因和相应产物存在多种蛋白酶基因和相应产物.外源外源DNA导入细胞后不稳定，易发生重组反应导入细胞后不稳定，易发生重组反应3)克隆载体克隆载体.复制子来源复制子来源i)质粒质粒DNA质粒名称质粒名称大小大小(kb)标记基因标记基因拷贝数拷贝数来来源源pUB4.5Kanr50金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌pE1943.7Eryr10同上同上pC1942.9Cmlr同上同上pSA05014.1Strr20-50同上同上pBC61蜡状芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌pLS103B.subtilispFTB14淀粉液状芽孢杆菌淀粉液状芽孢杆菌pAB124Tcr嗜热脂肪芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌pTB1925.8KanrTcr同上同上pT1814.4Tcr蜡状芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌pCW7同上同上pAM1S.faecalisii)噬菌体噬菌体10539.2kbB.subtilis温和噬菌体温和噬菌体Q1190kb同上同上当外源当外源DNA插入上述载体时，插入上述载体时，105生长的功能丧失生长的功能丧失,当重当重组组DNA分子转入已含有分子转入已含有105的溶源化菌株时，重组的溶源化菌株时，重组DNA分分子可以十分有效地插入染色体子可以十分有效地插入染色体DNA中。这种技术称之为中。这种技术称之为原原噬菌体转移技术噬菌体转移技术ii.标记基因标记基因)抗生素抗性基因抗生素抗性基因)thy基因基因(三甲氧苄二氨嘧啶三甲氧苄二氨嘧啶)：该基因表达可导致枯草：该基因表达可导致枯草杆菌死亡，但当外源杆菌死亡，但当外源DNA插入该基因后，宿主细胞便插入该基因后，宿主细胞便能存活能存活iii.表达载体的启动子表达载体的启动子常用的有液化芽孢杆菌的常用的有液化芽孢杆菌的-淀粉酶基因启动子和淀粉酶基因启动子和sp2启动子启动子2.其它其它G+克隆载体克隆载体1)枯草杆菌的克隆载体常可用于其它芽孢杆菌和金黄枯草杆菌的克隆载体常可用于其它芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌色葡萄球菌2)嗜热芽孢杆菌、肺炎双球菌常采用自身的天然质粒嗜热芽孢杆菌、肺炎双球菌常采用自身的天然质粒所组建的克隆载体所组建的克隆载体三、链霉菌克隆载体三、链霉菌克隆载体1.质粒载体质粒载体质粒名称质粒名称大小大小(kb)来源来源宿主范围宿主范围拷贝数拷贝数SLP1.214.5天兰色链霉菌窄谱,变青链霉菌4-5SCP2(性因子)1-3pIJ1018.9变青链霉菌广谱(各种载体构建)40-300pFJ10320S.granulorubor生二素,金霉素,弗氏链霉菌pUC69.2S.cepinosue广谱30-402.噬菌体载体噬菌体载体C31-天兰色链霉菌的温和噬菌体，长天兰色链霉菌的温和噬菌体，长41kb，其中，其中32kb是必须的是必须的,具粘性末端的线状具粘性末端的线状DNA分子，可插入约分子，可插入约10kb外外源源DNA，可裂解和溶源化生长。，可裂解和溶源化生长。3.标记基因标记基因杂合致死杂合致死（lethal zygosis,Ltz)lethal zygosis,Ltz)：凡是含有接合质粒的：凡是含有接合质粒的链霉菌可在一受体链霉菌菌丝体上形成麻点，这种转移可导链霉菌可在一受体链霉菌菌丝体上形成麻点，这种转移可导致受体菌生长受到抑制，常用的受体菌是变青链霉菌，这种致受体菌生长受到抑制，常用的受体菌是变青链霉菌，这种表型也可用于转化体的选择。表型也可用于转化体的选择。第四节第四节真菌分子克隆载体真菌分子克隆载体一、酿酒酵母一、酿酒酵母(Saccharomycea cerevisiae)的的分子克隆载体分子克隆载体1.克隆载体的种类克隆载体的种类1)按复制方式划分按复制方式划分i.自主复制型；自主复制型；ii.整合型（非自主复制型）整合型（非自主复制型）YeastIntegrationplasmid(YIp)2)按复制子来源划分按复制子来源划分i.附加体型附加体型-yeastepisomalplasmid(YEp)，其复制起，其复制起点来自于酿酒酵母的天然质粒点来自于酿酒酵母的天然质粒-2质粒质粒ii.染色体复制型染色体复制型-YeastReplicatingplasmid(YRp)，其，其复制起点来自染色体上的自主复制序列复制起点来自染色体上的自主复制序列(ARS-autonomousreplicatingsequence)酿酿酒酒酵酵母母载载体体的的种种类类和和构构建建*若在若在YRp中插入酿酒酵母的着丝粒序列，该种载中插入酿酒酵母的着丝粒序列，该种载体体YCp-YeastCentrometricplasmid*若在若在YCp或或YRp中插入一段酵母的端粒结构，该中插入一段酵母的端粒结构，该质粒称之为质粒称之为YLp-YeastLinearplasmid*若将若将YLp质粒构建成环状分子质粒构建成环状分子,该质粒称之为该质粒称之为pYAC载体载体(YeastArtificialChromosome)3)标记基因标记基因 大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结构大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结构基因作为选择标记，如基因作为选择标记，如ARG4ARG4，LEU2LEU2，TRP1TRP1，HIS3HIS3和和URA3URA3。使用这些遗传标记时，受体菌应是相应标记基。使用这些遗传标记时，受体菌应是相应标记基因的突变型，且是稳定的突变体（缺失突变或多点突因的突变型，且是稳定的突变体（缺失突变或多点突变），利用遗传互补进行转化体选择的，重组子则是变），利用遗传互补进行转化体选择的，重组子则是靠在靠在E.coliE.coli的转化体中来鉴别的。的转化体中来鉴别的。2.酵母克隆载体的结构与特点酵母克隆载体的结构与特点1)穿梭载体，穿梭载体，YIp除外除外2)有适合两种生物的标记基因有适合两种生物的标记基因3)环状或线状环状或线状DNA 详见下表详见下表载体类型载体类型存在方式存在方式所需所需DNA序列序列标记基因标记基因转化频率转化频率稳定性稳定性（菌落（菌落/gDNA）无丝分裂）无丝分裂有丝分裂有丝分裂整合型整合型整合整合与染色体与染色体DNAAprTcr10+a+a(YIp5)1-几个拷贝几个拷贝同源同源URA3附加体型附加体型自主复制自主复制2质粒质粒AprTcr103-104-b-c(YEp13)多拷贝多拷贝LEU2复制型复制型自主复制自主复制ARSAprTcr103-104-b-c(YRp7)多拷贝多拷贝TRP1着丝粒型着丝粒型染色体状染色体状ARS,CENApr103-104+d+d(YCp19)通常单拷贝通常单拷贝TRP1,URA3线型线型染色体状染色体状ARS，CENTRP1，HIS3103-104+e+(YLp21)通常单拷贝通常单拷贝TELa.每次细胞分裂仍有约每次细胞分裂仍有约1%的载体的载体DNA从染色体上脱落下来从染色体上脱落下来b.在选择培养基中在选择培养基中15-20代后，代后，10-30%的转化子丢失载体的转化子丢失载体DNAc.非孟德尔式分离，主要是非孟德尔式分离，主要是4+：0-d.无丝分裂时有无丝分裂时有3-14%转化体丢失质粒，有丝分裂时有转化体丢失质粒，有丝分裂时有3%转化体质粒不发生分离转化体质粒不发生分离在选择培养基上丢失质粒的转化体低于在选择培养基上丢失质粒的转化体低于1%1%酿酒酵母各种载体的特征酿酒酵母各种载体的特征3.YIp载体载体 该类载体只有依靠本身携带的酵母基因与酵母染色体上的同源该类载体只有依靠本身携带的酵母基因与酵母染色体上的同源DNADNA整合到染色体上去。这种转化体十分稳定，但也可能发生第整合到染色体上去。这种转化体十分稳定，但也可能发生第二二次同源重组次同源重组(见图见图)。可用杂交方法证明整合和二次重组结果（如。可用杂交方法证明整合和二次重组结果（如图所示）。图所示）。I.宿主宿主DNA;II和和III.转化子转化子DNA(10道除外道除外);I和和II.LEU基因为探针基因为探针;III.pBRDNA为探针为探针;E1/道道1,4,7;E2/道道2,5,8;E1-E2/道道3,6,9和和10.假设上述假设上述YIp质粒长质粒长6kb,E1-E2双酶切得双酶切得2kb和和4kb两片段两片段;宿主菌染色体上标记基宿主菌染色体上标记基因用因用E1酶切得酶切得5kb片段片段,用用E2酶切得酶切得3kb片段片段.YIp载载体体和和杂杂交交示示意意图图载载体体的的整整合合和和重重组组4.YRp载体载体1）酵母染色体复制子和）酵母染色体复制子和ARS的保守性的保守性酵母染色体总长为酵母染色体总长为15,000kb,根据电镜观察结果预计有根据电镜观察结果预计有400个复制起点，根据基因克隆分离个复制起点，根据基因克隆分离ARS的实验结果估计有的实验结果估计有480个个ARS。2）YRp的特点的特点i.高频转化高频转化ii.转化子不稳定转化子不稳定iii.子代细胞质粒分散不均匀子代细胞质粒分散不均匀iv.从酵母转化体中可分离到与转化前相同的质粒从酵母转化体中可分离到与转化前相同的质粒DNAv.可整合到染色体中去，与可整合到染色体中去，与YIp整合过程相同。整合过程相同。YRp载体和杂交示意图载体和杂交示意图1-YRp12探针探针;2-URA3探针探针;3-ARS探针探针;4-pBR322探针探针假设宿主菌染色体的假设宿主菌染色体的ura3基因酶切得基因酶切得3kb片段片段,而而ARS片段片段酶切得酶切得1kb片段片段.3）YARp载体（酵母非着丝粒复制质粒）载体（酵母非着丝粒复制质粒）1.4kb酵母酵母DNA（EcoRI片段）自我连接而成，该质粒含有片段）自我连接而成，该质粒含有ARS1和和TRP1基因基因该质粒特点该质粒特点:i.高拷贝高拷贝,100-200/cell;ii.比比YRp质粒稳定质粒稳定;iii.可形成核小体可形成核小体;iv.减数分裂以减数分裂以4+:10分离分离YAR质粒的结构质粒的结构5.YEp载体载体1)酵母酵母2质粒质粒i.结构结构 ii.结构特点结构特点 2质粒的结构质粒的结构2质粒倒置区的质粒倒置区的同向和反向重复片段同向和反向重复片段2）2质粒载体质粒载体YIp中可插入整个或部分中可插入整个或部分2质粒质粒DNA构成构成YEp。大多数酿酒酵。大多数酿酒酵母菌株中都含有母菌株中都含有2质粒，质粒，YEp复制所需的酶可由复制所需的酶可由2质粒提供。质粒提供。YEp具有具有YRp载体相同的特点，它还可以与载体相同的特点，它还可以与2质粒发生重组。质粒发生重组。重组质粒不稳定，在无选择压力条件下可很快消失。利用此特点重组质粒不稳定，在无选择压力条件下可很快消失。利用此特点可除去酵母菌株中的天然质粒，即可除去酵母菌株中的天然质粒，即Cir+Ciro当当YEp进入宿主细胞后，其转化体内所含进入宿主细胞后，其转化体内所含DNA可得如下杂交图可得如下杂交图谱（设谱（设YEp为为8kb，BamHI有一单切点）有一单切点）1-YEp13探针探针;2-2质粒探针质粒探针;3-LEU2探针探针;4-pBR322探针探针6.YCp载体载体第一个着丝粒于第一个着丝粒于1980年分离自第三染色体年分离自第三染色体,现已从酿酒酵现已从酿酒酵母菌中分离到多个着丝粒母菌中分离到多个着丝粒,它们具有如下保守序列它们具有如下保守序列:足迹分析技术表明足迹分析技术表明,着丝粒中有一个着丝粒中有一个200-250bp的免受核酸的免受核酸酶作用的酶作用的DNA序列序列,可分为四个区。各着丝粒间不发生交叉可分为四个区。各着丝粒间不发生交叉杂交。杂交。YCp载体结构载体结构7.YLp载体载体真核细胞染色体的末端有两个独特的性质：能使染色体保持真核细胞染色体的末端有两个独特的性质：能使染色体保持稳定，能成功地进行稳定，能成功地进行DNA复制。这种末端复制。这种末端DNA称之为端粒。端称之为端粒。端粒结构与染色体其余部分的结构是不同的。人为诱发的染色体粒结构与染色体其余部分的结构是不同的。人为诱发的染色体断裂很不稳定，如果不能修复，将是致死的。环状质粒经限制断裂很不稳定，如果不能修复，将是致死的。环状质粒经限制酶切后的末端极不稳定，极易发生重组，或发生降解，或发生酶切后的末端极不稳定，极易发生重组，或发生降解，或发生重新环化。重新环化。最先用于构建最先用于构建YLp的端粒来自四膜虫的核糖体的端粒来自四膜虫的核糖体DNA，不同长，不同长度的度的YLp具有不同的特点具有不同的特点8.pYAC载体载体酵母菌人工染色体酵母菌人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)广广泛用于构建高等动植物基因组文库的构建泛用于构建高等动植物基因组文库的构建,由由YLp经适当改经适当改造后构建成造后构建成pYAC载体。载体。pYAC载体具有以下特点：载体具有以下特点：1）双双TEL位点；位点；2）三个酵母菌遗传标记基因；三个酵母菌遗传标记基因；3）一个一个SUP4基因用于检测重组子基因用于检测重组子，其原理是：，其原理是：SUP4是是tRNAtyr的赭色抑制突变基因，但把该基因转入酵母菌的的赭色抑制突变基因，但把该基因转入酵母菌的ade2赭色突变体时，宿主菌为白色菌落，要是在赭色突变体时，宿主菌为白色菌落，要是在SUP4基因基因中插入外源中插入外源DNA片段后在转化片段后在转化ade2宿主菌，转化子成红色宿主菌，转化子成红色菌落。菌落。pYAC载体的结构载体的结构9.酵母杂交系统载体酵母杂交系统载体主要用于研究主要用于研究DNA-蛋白质和蛋白质蛋白质和蛋白质-蛋白质之间的相互作蛋白质之间的相互作用，可用于新基因的克隆。该类载体可分为两类：用，可用于新基因的克隆。该类载体可分为两类：一类载体中存在一个一类载体中存在一个DNA-结合序列结合序列(BD)，它与已知的钓，它与已知的钓饵序列融合；另一类载体则含有基因表达激活序列（饵序列融合；另一类载体则含有基因表达激活序列（AD），），它则与未知或已知的捕猎序列融合。它则与未知或已知的捕猎序列融合。单杂交系统载体单杂交系统载体双杂交系统载体双杂交系统载体三杂交系统载体三杂交系统载体除上述普通型的各类载体外，还有其它不同功能的载体：除上述普通型的各类载体外，还有其它不同功能的载体：表达型表达型yeastexpressionplasmid;启动子探针型启动子探针型yeastpromoterplasmid,YPp;杂合型杂合型yeasthybridplasmid,YHp,与阅读框架探针型相同。与阅读框架探针型相同。双杂交系统和载体双杂交系统和载体二、丝状真菌克隆载体二、丝状真菌克隆载体1.丝状真菌的特点丝状真菌的特点1）属低等真核生物，结构简单，易于培养属低等真核生物，结构简单，易于培养2）基因结构与高等真核生物的基因结构具较大相似性，基因结构与高等真核生物的基因结构具较大相似性，如内含子数目、位置等如内含子数目、位置等3）用于生产某些具生物活性的基因产物更具吸引力，用于生产某些具生物活性的基因产物更具吸引力，如糖基化、蛋白质外泌如糖基化、蛋白质外泌4）有些丝状真菌的的遗传背景较为清楚有些丝状真菌的的遗传背景较为清楚2.丝状真菌克隆载体丝状真菌克隆载体1）自主复制载体自主复制载体，其复制起点来源于以下三类，其复制起点来源于以下三类DNA：i.线粒体质粒，如来自间型脉孢菌线粒体质粒，如来自间型脉孢菌(N.intermedia)线线粒体质粒粒体质粒:pBR322+线粒体质粒线粒体质粒+qa-2+pALS1转化粗糙脉孢菌转化粗糙脉孢菌pALS2（高频转化小质粒）（高频转化小质粒）ii.类质粒（类质粒（plasmid-like)，如由柄孢壳，如由柄孢壳(Fedospora auseniw)的类质粒的类质粒(2539bp)所构建的克隆载体可达所构建的克隆载体可达1000-9000/g的转化率，可重新分离，无重组发生，其复制起的转化率，可重新分离，无重组发生，其复制起点序列与酵母和海拉细胞线粒体质粒复制子序列相同。点序列与酵母和海拉细胞线粒体质粒复制子序列相同。iii.染色体复制子染色体复制子)构巢曲霉（构巢曲霉（A.nidulans)复制子复制子pILJ16(5.4kb)+AMA1(6.1kb)ARp1(4.5kb)转化频率转化频率20,000/106原生质体原生质体250ngDNA，可在黑曲霉，可在黑曲霉(A.niger)和米曲霉和米曲霉(A.oryzae)以相同转化频率转化。以相同转化频率转化。10-30copies/单倍体基因组单倍体基因组)玉米黑粉菌玉米黑粉菌(Ustilago maydis)复制子复制子9104/ngDNA，25copies/cell2）整合型载体）整合型载体由由E.coli克隆载体加上一适合于丝状真菌的标记基因克隆载体加上一适合于丝状真菌的标记基因构成，转化频率构成，转化频率1-10/gDNA3）标记基因）标记基因 amdsamds乙酰胺酶，乙酰胺酶，dirdir线粒体线粒体ATPATP合成酶，合成酶，qa-2-qa-2-分分解奎尼酸脱氢酶，解奎尼酸脱氢酶，acuDacuD异柠檬酸裂解酶，异柠檬酸裂解酶，HgyHgyr r潮霉潮霉素抗性。素抗性。