细菌学检验基本技术.pptx

许欣1细菌学检验细菌学检验基本技术许欣2第一节第一节 样本的采集与送检样本的采集与送检 在公共卫生及预防医学领域所涉及的细菌学检验样在公共卫生及预防医学领域所涉及的细菌学检验样本种类繁多，包括来自食品、化妆品、涉水产品、本种类繁多，包括来自食品、化妆品、涉水产品、消毒及卫生用品、环境及物品（水、土壤、空气，消毒及卫生用品、环境及物品（水、土壤、空气，各种物品）、正常人体及临床等的样本。各种物品）、正常人体及临床等的样本。许欣3一、临床样本的采集与送检一、临床样本的采集与送检（一）血及骨髓样本的采集（一）血及骨髓样本的采集1.采样时间：采样时间：发热期、用药之前、发热期、用药之前、病情发展病情发展2.采样部位及频率：采样部位及频率：多部位、高频率多部位、高频率3.样本采集的量：样本采集的量：成人血量成人血量10ml，婴儿，婴儿1ml2ml，儿，儿童童3ml5ml；当怀疑为真菌感染时，应采集双份量，；当怀疑为真菌感染时，应采集双份量，分别作双相培养分别作双相培养(37/28)。骨髓。骨髓1 ml2 ml。4.样本的送检：样本的送检：尽快，室温尽快，室温5.注意事项：注意事项：同时需氧和厌氧培养同时需氧和厌氧培养许欣4一、临床样本的采集与送检一、临床样本的采集与送检（二）尿液样本的采集（二）尿液样本的采集1.采样时间：采样时间：晨尿、用药前晨尿、用药前2.采样方法：采样方法：10ml，中段尿、肾盂尿、导尿，中段尿、肾盂尿、导尿3.注意事项：注意事项：无菌操作，用药前无菌操作，用药前（三）粪便样本的采集（三）粪便样本的采集1.采样时间：采样时间：急性期、新鲜粪便急性期、新鲜粪便2.采样方法：采样方法：自然排便、直肠拭子、自然排便、直肠拭子、Cary-Blair运送培运送培养基或养基或pH7.0的甘油的甘油PBS3.注意事项：注意事项：无菌操作、可能厌氧培养无菌操作、可能厌氧培养许欣5一、临床样本的采集与送检一、临床样本的采集与送检（四）痰及上呼吸道样本的采集（四）痰及上呼吸道样本的采集1.采样时间：采样时间：晨痰、鼻咽拭子晨痰、鼻咽拭子 2.采样方法：采样方法：自然咳痰法、支气管镜采集法、胃内采痰自然咳痰法、支气管镜采集法、胃内采痰法、气管穿刺法等法、气管穿刺法等；咽拭子；咽拭子3.注意事项：注意事项：先漱口、结核分枝杆菌和真菌可先漱口、结核分枝杆菌和真菌可4保存保存 许欣6一、临床样本的采集与送检一、临床样本的采集与送检（五）其它临床样本（五）其它临床样本化脓和创伤样本：化脓和创伤样本：棉拭子棉拭子 脑脊液、胆汁、胸水、腹水、心包液、关节液和鞘膜液脑脊液、胆汁、胸水、腹水、心包液、关节液和鞘膜液等：等：穿刺穿刺生殖道：生殖道：棉拭子棉拭子 组织样本：组织样本：内镜内镜炎症或组织坏死部位：炎症或组织坏死部位：手术手术 许欣7二、食品卫生细菌学检验样本二、食品卫生细菌学检验样本（一）样品采集原则（一）样品采集原则注意代表性，防止样品受污染、变质和细菌生长注意代表性，防止样品受污染、变质和细菌生长 大样大样(一整批一整批)、中样、中样(混合混合200g)和小样和小样(检样检样25g)（二）样品采集方法（二）样品采集方法无菌用具、包装完好、混合、震摇、冷冻、冷藏无菌用具、包装完好、混合、震摇、冷冻、冷藏（三）采样的数量（三）采样的数量根据食品种类的不同，采样的数量也应不同根据食品种类的不同，采样的数量也应不同（四）注意事项（四）注意事项3h内送实验室，无菌操作内送实验室，无菌操作许欣8三、化妆品细菌学检验样本三、化妆品细菌学检验样本（一）采样数量（一）采样数量每批两个大包装抽取每批两个大包装抽取4个包装，个包装，10g或或10ml（二）样本的处理（二）样本的处理1.液体样品：液体样品：10倍稀释，油性物用液体石蜡、土温倍稀释，油性物用液体石蜡、土温-80 2.膏霜乳剂样品：膏霜乳剂样品：亲水性亲水性-玻璃珠，疏水性玻璃珠，疏水性-先行乳化先行乳化3.固体样品的处理：固体样品的处理：均质后取上清液均质后取上清液（三）样品送检原则及注意事项（三）样品送检原则及注意事项1.维持样品污染原状（出厂污染状态）维持样品污染原状（出厂污染状态）2.去除残留防腐剂及抑菌剂（吐温去除残留防腐剂及抑菌剂（吐温-80和卵磷脂和卵磷脂）3.注意事项（室温存放，多项目时先做微生物）注意事项（室温存放，多项目时先做微生物）许欣9四、生活饮用水细菌学检验样本四、生活饮用水细菌学检验样本（一）水样采集（一）水样采集许多水体随时间和空间会发生很大变化，要采集具有代许多水体随时间和空间会发生很大变化，要采集具有代表性的样品，必须定出合理的采样规划。表性的样品，必须定出合理的采样规划。（二）采样点的选择（二）采样点的选择注意样品的代表性，河水、湖水、地下水、自来水注意样品的代表性，河水、湖水、地下水、自来水（三）采样器具（三）采样器具采样瓶、自动采样器、容器可加硫代硫酸钠采样瓶、自动采样器、容器可加硫代硫酸钠（四）样品送检及注意事项（四）样品送检及注意事项4h内检验、可冷藏内检验、可冷藏许欣10五、消毒及卫生用品五、消毒及卫生用品（一）医疗卫生机构消毒及卫生用品（一）医疗卫生机构消毒及卫生用品物表物表：5cm5cm灭菌规格板，灭菌规格板，100cm2 区域区域空气：空气：高度高度150cm、距墙、距墙100cm；面积；面积30m2，设，设一条对角线上内、中、外一条对角线上内、中、外3点；面积点；面积 30m2，设，设4角角及中央及中央5点，暴皿点，暴皿5min；或用采样器；或用采样器 手手/皮肤粘膜：皮肤粘膜：含中和剂棉拭子，含中和剂棉拭子，5cm5cm规格板规格板 医疗用品：医疗用品：破坏、棉拭子破坏、棉拭子消毒剂：消毒剂：1ml加至加至9ml中和剂中中和剂中 许欣11五、消毒及卫生用品五、消毒及卫生用品（二）一次性使用的卫生用品（二）一次性使用的卫生用品同一批号同一批号3个运输包装中至少随机抽取个运输包装中至少随机抽取12个最小包装个最小包装量；量；1/4用于检测、用于检测、1/4用于留样、用于留样、2/4就地封存准备复就地封存准备复测。测。许欣12六、空气样本六、空气样本平板沉降法和采样器采集法平板沉降法和采样器采集法（一）空气微生物采样器分类（一）空气微生物采样器分类按照采样方式的不同可分为两类按照采样方式的不同可分为两类(和和类类)，类是将类是将微生物直接采到固体培养基上微生物直接采到固体培养基上(如如Andersen采样器采样器)，类是把微生物先采到液体或其它介质上，再转种到培类是把微生物先采到液体或其它介质上，再转种到培养基或细胞上显示养基或细胞上显示(如如Porton采样器采样器)。许欣13六、空气样本六、空气样本按照流量的有效数字分，按照流量的有效数字分，3位数以上为大流量位数以上为大流量(500 L/min)，23位数为中流量位数为中流量(499L/min11 L/min)，1位位数为小流量数为小流量(10L/min)。按照采样器所用介质性质又可分为按照采样器所用介质性质又可分为固体及液体采样器固体及液体采样器。按采样器的工作原理可分为六种：按采样器的工作原理可分为六种：撞击式、沉降式、过撞击式、沉降式、过滤式、静电吸附式、旋风式和离心撞击式采样器滤式、静电吸附式、旋风式和离心撞击式采样器。许欣14六、空气样本六、空气样本（二）空气中细菌等微生物采样的介质（二）空气中细菌等微生物采样的介质采样介质采样介质(包括培养基包括培养基)对细菌等微生物具有支撑、黏附、对细菌等微生物具有支撑、黏附、保护和生长作用。常用有凡士林、聚硅酮，氧化烯二十保护和生长作用。常用有凡士林、聚硅酮，氧化烯二十二烷酮二烷酮(OED)和和SGB(糖、甘油、牛血清白蛋白糖、甘油、牛血清白蛋白)（三）空气中细菌等微生物采样方法及送检（三）空气中细菌等微生物采样方法及送检1.平板沉降法：参见医院空气采样规定。平板沉降法：参见医院空气采样规定。2.空气采样器采样：常用空气采样器采样：常用Andersen采样器采样器许欣15第二节第二节 细菌的形态结构检查法细菌的形态结构检查法了解标本中有无细菌及其大致的数量。了解标本中有无细菌及其大致的数量。验证培养物是否为纯种。验证培养物是否为纯种。形态检查结果可做初步诊断。形态检查结果可做初步诊断。不染色检查法和染色检查法。不染色检查法和染色检查法。借助显微镜对形态、大小、排列、结构的直接观察。借助显微镜对形态、大小、排列、结构的直接观察。许欣16一、显微镜检查一、显微镜检查1、普通光学显微镜、普通光学显微镜(light microscope)：分辨率：分辨率0.2m，用于细菌染色标本的观察。用于细菌染色标本的观察。2、暗视野显微镜、暗视野显微镜(dark-field microscope)：具有暗视野聚：具有暗视野聚光器，用于观察不染色标本活菌的形态、运动方式。光器，用于观察不染色标本活菌的形态、运动方式。3、相差显微镜、相差显微镜(phase contrast microscope)：具有环状光：具有环状光栅聚光器和相差物镜，既可观察活体细胞的外形和运动栅聚光器和相差物镜，既可观察活体细胞的外形和运动方式，又能观察其内部细微结构及这些结构的数量。方式，又能观察其内部细微结构及这些结构的数量。许欣17二、不染色检查二、不染色检查细菌的活体观察，主要用于观察动力细菌的活体观察，主要用于观察动力悬滴法悬滴法凹玻片凹玻片压滴法压滴法平玻片平玻片许欣18三、染色检查三、染色检查常用碱性染料常用碱性染料（美蓝、孔雀绿、碱性复红、结晶紫、（美蓝、孔雀绿、碱性复红、结晶紫、沙黄等）沙黄等）单染色法，复染色法，特殊结构染色法单染色法，复染色法，特殊结构染色法（鞭毛、芽孢、（鞭毛、芽孢、荚膜等），荚膜等），负染色法、荧光染色法，革兰染色法负染色法、荧光染色法，革兰染色法（结（结晶紫、碘液、晶紫、碘液、95%酒精、碱性复红），酒精、碱性复红），抗酸染色法抗酸染色法（分枝杆菌、石炭酸复红、美蓝）（分枝杆菌、石炭酸复红、美蓝）许欣19大肠杆菌革兰染色阴性大肠杆菌革兰染色阴性 许欣20金黄色葡萄球菌革兰染色阳性金黄色葡萄球菌革兰染色阳性 许欣21变形杆菌周身鞭毛变形杆菌周身鞭毛许欣22绿脓杆菌单鞭毛绿脓杆菌单鞭毛许欣23肺炎链球菌荚膜肺炎链球菌荚膜许欣24钩端螺旋体钩端螺旋体许欣25霍乱弧菌霍乱弧菌许欣26破伤风芽胞杆菌破伤风芽胞杆菌许欣27第三节第三节 细菌的分离培养方法细菌的分离培养方法所谓细菌的分离培养就是提供某细菌生长所需的各种条所谓细菌的分离培养就是提供某细菌生长所需的各种条件（营养、温度、湿度、酸碱度和气体），将其从微生件（营养、温度、湿度、酸碱度和气体），将其从微生物混合物中培养出来的方法。物混合物中培养出来的方法。在细菌的分离培养过程中，必须采用无菌技术或称无菌在细菌的分离培养过程中，必须采用无菌技术或称无菌操作。操作。许欣28许欣29一、培养基的制备一、培养基的制备（一）培养基的种类：（一）培养基的种类：1.按用途分类按用途分类基础培养基：基础培养基：仅最基本的营养成分。仅最基本的营养成分。营养培养基：营养培养基：在基础培养基上加入葡萄糖、血液、血清等。在基础培养基上加入葡萄糖、血液、血清等。增菌培养基：增菌培养基：多为液体培养基，一般含有抑制剂，且是具有多为液体培养基，一般含有抑制剂，且是具有选择性抑制作用的抑制剂。选择性抑制作用的抑制剂。选择性培养基：选择性培养基：多为固体培养基，加有抑制物质，抑制其它多为固体培养基，加有抑制物质，抑制其它非目的菌的生长或使其生长不佳。非目的菌的生长或使其生长不佳。鉴别培养基：鉴别培养基：主要供细菌生化反应试验用。主要供细菌生化反应试验用。专用培养基：专用培养基：适用于特定细菌的专门的培养基。适用于特定细菌的专门的培养基。许欣30一、培养基的制备一、培养基的制备2.按物理性状分类按物理性状分类液体培养基液体培养基半固体培养基（琼脂含量半固体培养基（琼脂含量0.30.8%）固体培养基（琼脂含量固体培养基（琼脂含量1.22.0%）3.按成分分类：按成分分类：合成培养基：合成培养基：由化学物质和成分已知的各种物质所组成，可由化学物质和成分已知的各种物质所组成，可以是无机盐类，或无机盐类加有机物质。以是无机盐类，或无机盐类加有机物质。天然培养基：天然培养基：化学成分不完全清楚，各批物质的成分很难一化学成分不完全清楚，各批物质的成分很难一致，如蛋白胨、牛肉膏、血液、鸡蛋。致，如蛋白胨、牛肉膏、血液、鸡蛋。许欣31一、培养基的制备一、培养基的制备（二）培养基的主要成分及其作用（二）培养基的主要成分及其作用1.营养物质：营养物质：碳源、氮源及其它营养物质（蛋白胨、肉碳源、氮源及其它营养物质（蛋白胨、肉浸液、牛肉浸膏、糖类、血液、鸡蛋、动物血清、酵母浸液、牛肉浸膏、糖类、血液、鸡蛋、动物血清、酵母粉、生长因子、无机盐类）。粉、生长因子、无机盐类）。2.水分：水分：常用蒸馏水。常用蒸馏水。3.凝固物质：凝固物质：琼脂琼脂4.抑制剂和指示剂：抑制剂和指示剂：如胆盐、抗生素、染料等。如胆盐、抗生素、染料等。许欣32一、培养基的制备一、培养基的制备3、制备培养基的一般程序、制备培养基的一般程序调配、矫正调配、矫正pH、过滤澄清、分装、灭菌、检定、保存、过滤澄清、分装、灭菌、检定、保存七个步骤。七个步骤。高压蒸汽灭菌（高压蒸汽灭菌（121、115 ）、流动蒸汽灭菌）、流动蒸汽灭菌（100）、血清凝固器灭菌（、血清凝固器灭菌（80）、水浴低温灭、水浴低温灭菌（菌（56）许欣33二、细菌接种方法二、细菌接种方法（二）细菌的接种方法（二）细菌的接种方法1.平板划线接种法（分离、鉴别平板划线接种法（分离、鉴别）2.斜面接种法（纯培养、转种斜面接种法（纯培养、转种）3.半固体培养基接种法（观察动力和保存菌种半固体培养基接种法（观察动力和保存菌种）4.液体培养基接种法液体培养基接种法（富集培养、生化反应等（富集培养、生化反应等）5.平板涂布、倾注接种法（药敏、活菌计数等）平板涂布、倾注接种法（药敏、活菌计数等）许欣34三、细菌的培养方法三、细菌的培养方法1.需氧培养法（常规培养）需氧培养法（常规培养）2.CO2培养法培养法CO2孵箱法（孵箱法（CO2钢瓶钢瓶）烛缸法（烛缸法（CO2含量约为含量约为510，氧气约，氧气约16%）化学法（如碳酸氢钠化学法（如碳酸氢钠-盐酸法）盐酸法）许欣35三、细菌的培养方法三、细菌的培养方法3.厌氧培养法厌氧培养法液体培养基的培养（凡士林、疱肉、还原剂等）液体培养基的培养（凡士林、疱肉、还原剂等）固体培养基的培养（厌氧罐培养法，厌氧气袋法，固体培养基的培养（厌氧罐培养法，厌氧气袋法，厌氧培养箱法厌氧培养箱法，气体喷射培养法（或称转管法），气体喷射培养法（或称转管法）许欣36四、细菌的生长现象四、细菌的生长现象（一）（一）细菌在固体培养基上的生长现象细菌在固体培养基上的生长现象菌落形状、大小、表面性状、边缘情况、颜色、透明度、菌落形状、大小、表面性状、边缘情况、颜色、透明度、质地、粘度、乳化性。质地、粘度、乳化性。血平板血平板(溶血、溶血、溶血、溶血、双环、双环)卵黄琼脂卵黄琼脂(卵磷脂酶和脂酶：沉淀环和卵磷脂酶和脂酶：沉淀环和“珍珠包膜珍珠包膜”)蛋白水解蛋白水解(清晰的环清晰的环)色素色素(水溶性，如绿脓色素、荧光色素等，脂溶性色素，水溶性，如绿脓色素、荧光色素等，脂溶性色素，如金黄色葡萄球菌的金黄色菌落如金黄色葡萄球菌的金黄色菌落)许欣37四、细菌的生长现象四、细菌的生长现象气味（假单胞菌属：葡萄汁气味；变形杆菌：巧克力烧气味（假单胞菌属：葡萄汁气味；变形杆菌：巧克力烧焦的臭味；链球菌：霉臭；梭菌：粪臭、腐败味；产黑焦的臭味；链球菌：霉臭；梭菌：粪臭、腐败味；产黑色素类杆菌属细菌：辛辣味）色素类杆菌属细菌：辛辣味）（二）（二）细菌在液体培养基中的生长现象细菌在液体培养基中的生长现象18h24h，包括：发育程度、浑浊度、沉淀、液体表，包括：发育程度、浑浊度、沉淀、液体表面性状、其它（色素、气味、产酸、气体）面性状、其它（色素、气味、产酸、气体）（三）（三）细菌在半固体培养基中的生长现象细菌在半固体培养基中的生长现象动力观察动力观察许欣38第四节第四节 细菌的生化反应检查法细菌的生化反应检查法一、糖类代谢试验一、糖类代谢试验1.糖糖(醇醇)发酵试验发酵试验糖类是作为碳源和能量来源提供细菌合成菌体成分必需糖类是作为碳源和能量来源提供细菌合成菌体成分必需的原料，由于细菌各自具有不同的酶系统，故对糖的原料，由于细菌各自具有不同的酶系统，故对糖(醇醇)类的分解能力不尽相同。类的分解能力不尽相同。酚红、溴麝香草酚蓝、溴甲酚紫和酸性复红等指示剂酚红、溴麝香草酚蓝、溴甲酚紫和酸性复红等指示剂液体、半固体、固体培养基液体、半固体、固体培养基 双糖双糖(或三糖或三糖)高层斜面高层斜面许欣39一、糖类代谢试验一、糖类代谢试验2.甲基红（甲基红（MR）试验）试验分解葡萄糖分解葡萄糖丙酮酸丙酮酸乳酸、乙酸、甲酸乳酸、乙酸、甲酸 pH4.5以下以下加入甲基红指示剂加入甲基红指示剂红色。红色。3.伏普伏普(Voges-Proskauer)试验试验(V-P试验试验)葡萄糖代谢葡萄糖代谢中性最终产物乙酰甲基甲醇。葡萄糖中性最终产物乙酰甲基甲醇。葡萄糖丙丙酮酸酮酸乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇碱性溶液空气氧化碱性溶液空气氧化二乙酰（丁二乙酰（丁二酮）二酮）加入胍基（如肌酸或肌酐、加入胍基（如肌酸或肌酐、-萘酚等）萘酚等）红红色化合物。色化合物。许欣40一、糖类代谢试验一、糖类代谢试验4.-半乳糖苷酶试验半乳糖苷酶试验结构酶和适应酶（诱导酶）结构酶和适应酶（诱导酶）迅速，延迟，不发酵乳糖迅速，延迟，不发酵乳糖发酵乳糖的大肠菌能产生乳糖渗透酶和发酵乳糖的大肠菌能产生乳糖渗透酶和-半乳糖苷酶半乳糖苷酶邻邻-硝基苯硝基苯-D-吡喃半乳糖苷吡喃半乳糖苷(ONPG)证明有无证明有无-半乳糖半乳糖苷酶活性，可预测细菌发酵乳糖的能力。苷酶活性，可预测细菌发酵乳糖的能力。菌悬液菌悬液+ONPG，无色的，无色的ONPG被水解，释放出黄色化被水解，释放出黄色化合物邻合物邻-硝基苯酚硝基苯酚(ONP)许欣41二、氨基酸和蛋白质代谢试验二、氨基酸和蛋白质代谢试验1.靛基质靛基质(吲哚吲哚)试验试验细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，吲哚可与试剂细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，吲哚可与试剂中的二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚，为红色化合中的二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚，为红色化合物。物。2.硫化氢试验硫化氢试验某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸生成某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸生成H2S，H2S可与加入培养基中的铅或铁离子生成黑色硫化物。可与加入培养基中的铅或铁离子生成黑色硫化物。许欣42二、氨基酸和蛋白质代谢试验二、氨基酸和蛋白质代谢试验3.尿素酶试验尿素酶试验有些细菌有些细菌(如某些变形杆菌如某些变形杆菌)具有尿素分解酶，能分解尿具有尿素分解酶，能分解尿素形成大量的氨，使培养基素形成大量的氨，使培养基pH上升，而变成碱性，使上升，而变成碱性，使含有酚红指示剂的培养基变成红色。含有酚红指示剂的培养基变成红色。4.明胶液化试验明胶液化试验某些细菌产生明胶酶可使明胶分解，失去凝固力，使其某些细菌产生明胶酶可使明胶分解，失去凝固力，使其由半固体转化为液体状态。由半固体转化为液体状态。许欣43三、有机酸盐和铵盐利用试验三、有机酸盐和铵盐利用试验1.柠檬酸盐利用试验柠檬酸盐利用试验有些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一的碳源，能在除柠檬有些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一的碳源，能在除柠檬酸盐外不含其它碳源的培养基上生长，分解柠檬酸盐，酸盐外不含其它碳源的培养基上生长，分解柠檬酸盐，生成碳酸钠，使培养基变成碱性。生成碳酸钠，使培养基变成碱性。2.马尿酸钠水解试验马尿酸钠水解试验B群链球菌具有马尿酸水解酶，可使马尿酸水解为苯甲群链球菌具有马尿酸水解酶，可使马尿酸水解为苯甲酸和甘氨酸。苯甲酸与三氯化铁结合而沉淀或甘氨酸与酸和甘氨酸。苯甲酸与三氯化铁结合而沉淀或甘氨酸与茚三酮作用生成紫色化合物。茚三酮作用生成紫色化合物。许欣44三、有机酸盐和铵盐利用试验三、有机酸盐和铵盐利用试验3.丙二酸盐利用试验丙二酸盐利用试验某些细菌利用丙二酸盐作为唯一碳源时，丙二酸钠可被某些细菌利用丙二酸盐作为唯一碳源时，丙二酸钠可被分解生成碳酸钠，使培养基变碱性。分解生成碳酸钠，使培养基变碱性。许欣45四、酶类试验四、酶类试验1.氧化酶试验（氧化酶试验（Kovacs试验）试验）氧化酶（又称细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统氧化酶（又称细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，能使还原型的细胞色素的终末呼吸酶，能使还原型的细胞色素C氧化成氧化型氧化成氧化型的细胞色素的细胞色素C，氧化型细胞色素，氧化型细胞色素C又使对苯二胺氧化，又使对苯二胺氧化，生成红色的醌类化合物。生成红色的醌类化合物。2.过氧化氢酶试验（触酶试验）过氧化氢酶试验（触酶试验）过氧化氢酶又称触酶，可使细菌代谢过程中的过氧化氢过氧化氢酶又称触酶，可使细菌代谢过程中的过氧化氢分解为水和氧。分解为水和氧。许欣46四、酶类试验四、酶类试验3.硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验某些革兰氏阴性杆菌在代谢过程中，硝酸盐某些革兰氏阴性杆菌在代谢过程中，硝酸盐还原为亚还原为亚硝酸盐硝酸盐亚硝酸盐亚硝酸盐+醋酸醋酸亚硝酸亚硝酸+对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸重氮重氮苯磺酸苯磺酸+-萘胺萘胺红色的红色的N-萘胺偶氮苯磺酸。萘胺偶氮苯磺酸。4.过氧化物酶试验过氧化物酶试验过氧化物酶的作用是将过氧化氢中氧转移给可被氧化的过氧化物酶的作用是将过氧化氢中氧转移给可被氧化的物质。以联苯胺作为被氧化的物质，如为过氧化物酶阳物质。以联苯胺作为被氧化的物质，如为过氧化物酶阳性细菌，加入过氧化氢可使联苯胺氧化成为蓝色。性细菌，加入过氧化氢可使联苯胺氧化成为蓝色。许欣47第五节第五节 细菌的血清学检验细菌的血清学检验血清学鉴定（血清学鉴定（serological identity）已知诊断血清鉴定分离的细菌已知诊断血清鉴定分离的细菌 血清学诊断（血清学诊断（Serological diagnosis）已知标准菌株测抗体，已知标准菌株测抗体，4倍上升倍上升（一）凝集试验（一）凝集试验（Agglutination test）玻片法和试管法玻片法和试管法（二）沉淀试验（二）沉淀试验（precipitation test）环状沉淀试验，絮状沉淀试验，凝胶中沉淀试验环状沉淀试验，絮状沉淀试验，凝胶中沉淀试验许欣48第六节第六节 细菌毒素的检测细菌毒素的检测一、外毒素一、外毒素主要来自主要来自G+菌，蛋白质，不耐热，抗原性强，选择毒性菌，蛋白质，不耐热，抗原性强，选择毒性抗体与滤液反应；已知细菌外毒素与患者血清反应；动抗体与滤液反应；已知细菌外毒素与患者血清反应；动物试验物试验(如破伤风痉挛毒素如破伤风痉挛毒素)1.白喉外毒素白喉外毒素(diphtheria exotoxin)：Elek平板、动平板、动物实验物实验2.肉毒毒素肉毒毒素(botulinic toxin)：动物实验、中和试验：动物实验、中和试验许欣49二、内毒素二、内毒素主要来自主要来自G-菌，菌，LPS，耐热，抗原性弱，普遍毒性，耐热，抗原性弱，普遍毒性1.家兔热原试验（家兔热原试验（rabbit pyrogen test，RT）2.鲎试验（鲎试验（limulus test，LT）3.其它试验其它试验（免疫学、生物学、化学发光、流式细胞术、（免疫学、生物学、化学发光、流式细胞术、高效液相等）高效液相等）许欣50第七节第七节 细菌数量的测定细菌数量的测定一、物理计数法一、物理计数法1.Breed计数法：计数法：100mm2区域，区域，0.01ml涂片，亚甲兰涂片，亚甲兰染色，油镜视野（染色，油镜视野（0.02mm2）2.比浊管计数法：比浊管计数法：BaSO4系列标准管系列标准管3.分光光度计测定法：标准曲线分光光度计测定法：标准曲线许欣51二、生物计数法二、生物计数法1.半定量计数法半定量计数法(接种环接种环0.01ml或或0.001ml，平皿划线，平皿划线)2.倾注平板法：最常用倾注平板法：最常用3.旋管计数法：加样后试管液态琼脂水平旋转，低倍镜旋管计数法：加样后试管液态琼脂水平旋转，低倍镜计数计数 4.滴液计数法：滴液计数法：0.02ml样液直接滴加平板样液直接滴加平板许欣52二、生物计数法二、生物计数法5.琼脂表面计数法：琼脂表面计数法：0.1ml样液，样液，L-型玻棒涂抹型玻棒涂抹 6.膜滤过计数法：适合于含菌量低的水等样品膜滤过计数法：适合于含菌量低的水等样品7.微菌落快速计数法：醋酸纤维素薄膜及透明固定液微菌落快速计数法：醋酸纤维素薄膜及透明固定液(乙醇乙醇80ml与冰醋酸与冰醋酸20ml)，5小时培养，染色后低倍镜小时培养，染色后低倍镜观察。观察。8.最可能数最可能数(MPN)的估计的估计 许欣53第八节第八节 L-型细菌检查法型细菌检查法L-型细菌是一种细菌通过变异而产生的细胞壁缺陷型。型细菌是一种细菌通过变异而产生的细胞壁缺陷型。已知几乎所有的细菌都可形成已知几乎所有的细菌都可形成L-型。型。真菌、放线菌、螺旋体、立克次氏体和衣原体等也可出真菌、放线菌、螺旋体、立克次氏体和衣原体等也可出现细胞壁的缺陷。现细胞壁的缺陷。L-型细菌亦有致病作用，并与许多慢性反复发作的感染型细菌亦有致病作用，并与许多慢性反复发作的感染有关。有关。许欣54第八节第八节 L-型细菌检查法型细菌检查法营养要求较高，培养基的成分应在脑心浸液或牛肉浸汤营养要求较高，培养基的成分应在脑心浸液或牛肉浸汤的基础上，另需加入的基础上，另需加入1020%血浆血浆(或血清或血清)。标本先用高渗标本先用高渗/等渗肉汤增菌再转种血平板和等渗肉汤增菌再转种血平板和L型平板。型平板。低倍显微镜下：低倍显微镜下：油煎蛋样菌落；油煎蛋样菌落；颗粒型菌落，易回颗粒型菌落，易回复；复；丝状型菌落，不易从培养基上刮下，制片时也不丝状型菌落，不易从培养基上刮下，制片时也不易分散乳化。易分散乳化。革兰染色为多形性，细胞壁染色革兰染色为多形性，细胞壁染色(鞣酸，甲紫鞣酸，甲紫)可分辨细可分辨细胞壁缺失情况。胞壁缺失情况。许欣55第八节第八节 L-型细菌检查法型细菌检查法一般从样本中分离到的一般从样本中分离到的L-型细菌，大多不稳定，可以通型细菌，大多不稳定，可以通过在培养基上转种，回复成普通细菌后进行鉴定。过在培养基上转种，回复成普通细菌后进行鉴定。L-平板上的平板上的L型菌落转种于等渗内汤。型菌落转种于等渗内汤。较稳定的较稳定的L型细菌不易回复，可用免疫荧光型细菌不易回复，可用免疫荧光(测抗原测抗原)、PAP系统染色系统染色(测抗原测抗原)、SDS-PAGE(蛋白质图谱蛋白质图谱)、DNA同源性测定。同源性测定。