乳制品中蜡样芽孢杆菌的检测及消长规律研究.pdf

2015年年 11 11 月月 1212日日 王王 娉娉 中国检验检疫科学研究院中国检验检疫科学研究院 乳制品中蜡样芽孢杆菌的检测及其 消长规律研究 第五届全国食品微生物检测与控制技术交流会第五届全国食品微生物检测与控制技术交流会 蜡样芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)革兰氏阳性杆菌，需氧，产芽孢；广泛分布于自然界，能在多种环境中存活；生长温度范围广4 C-55 C，最适生长温度28 C-35 C；易污染蛋白质和碳水化合物含量丰富的食品；许多国家对其在食品中的限量都有明确规定；我国的相关食品标准中尚没有明确蜡样芽孢杆菌的限量，对该菌的要求大多是按照进食污染菌量 105cfu/g(mL)的食物，就可发生食物中毒的标准进行检验控制。条件致病菌，主要是通过产生腹泻毒素和呕吐毒素导致人类食物中毒，还可引起胃肠道外感染如败血症、心内膜炎、肺部感染等。蜡样芽孢杆菌与食源性疾病蜡样芽孢杆菌与食源性疾病 我国由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒以呕吐型为主。国外以乳制品污染引起的食物中毒多见；而我国以剩饭引起的食物中毒多见。蜡样芽孢杆菌与食源性疾病蜡样芽孢杆菌与食源性疾病 蜡样芽孢杆菌主要通过产生腹泻毒素和呕吐毒素导致人类食物中毒；呕吐毒素的主要成分为cereulide，是一种十二环肽，是一种不易裂解的耐热性毒素，编码基因ces；HBL、NHE和 EntK是引起以腹泻为主食物中毒的重要肠毒素，其中hbl 与nhe 各有3 个不同的基因亚型，分别为hblA、hblC、hblD 与nheA、nheB、nheC;HBL需要hblA、hblC、hblD 3 个基因均为阳性时才具有毒性;而nheA、nheB、nheC 3 个基因均为阳性时NHE的毒性最强。蜡样芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌引起引起的食物中毒事件的食物中毒事件 蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒在全国各省都有报道，但以南方省份发病起数较多；蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒以夏秋季最为多见。蜡样芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌引起引起的食物中毒事件的食物中毒事件 6.4 4.2 6.9 5.6 4.5 2.6 3.1 3.1 0123456782010201120122013中毒事件组成比(%)中毒人员组成比(%)2010-2013年我国食源性蜡样芽孢杆菌中毒事件 乳制品中蜡样芽孢杆菌的污染情况乳制品中蜡样芽孢杆菌的污染情况 乳制品中蜡样芽孢杆菌的污染情况乳制品中蜡样芽孢杆菌的污染情况 章乐怡章乐怡,张秀尧张秀尧,李李毅等毅等.婴幼儿奶粉和米粉中蜡样芽孢杆菌及其毒素、毒力基因的调查研究婴幼儿奶粉和米粉中蜡样芽孢杆菌及其毒素、毒力基因的调查研究J.中国食品卫生杂志中国食品卫生杂志,2014,26(6):600-604 乳制品中蜡样芽孢杆菌的污染情况乳制品中蜡样芽孢杆菌的污染情况 闫韶飞闫韶飞,闫旭闫旭,甘辛等甘辛等.我国市售婴幼儿配方乳粉中蜡样芽孢杆菌污染及其独立基因调查我国市售婴幼儿配方乳粉中蜡样芽孢杆菌污染及其独立基因调查J.中国食品卫生杂志中国食品卫生杂志,2015,27(3):286-290 婴幼儿配方粉婴幼儿配方粉 当下中国50%以上的妈妈会给宝宝喂养配方奶粉；随着政府二孩政策的推出，以及90、80年新生代青年生育高峰来临，新生儿数量呈上升趋势，庞大的消费群体孕育着庞大的市场空间；近年来，伴随着我国乳品行业和婴幼儿食品行业的快速发展，我国婴幼儿奶粉市场持续走高；营养与安全是消费者最为关注的问题。婴幼儿配方粉中蜡样芽孢杆菌管理现状婴幼儿配方粉中蜡样芽孢杆菌管理现状 美国FDA规定婴幼儿配方粉中蜡样芽孢杆菌不超过1000 CFU/g，拟严格到100 CFU/g。婴幼儿配方粉中蜡样芽孢杆菌管理现状婴幼儿配方粉中蜡样芽孢杆菌管理现状 尚没有统一的标准；荷兰、葡萄牙、匈牙利和波兰规定婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的 限量标准为100 CFU/g；丹麦规定婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的限量为0.01 g样品中不得 检出 婴幼儿配方粉中蜡样芽孢杆菌管理现状婴幼儿配方粉中蜡样芽孢杆菌管理现状 婴幼儿配方粉中蜡样芽孢杆菌管理现状婴幼儿配方粉中蜡样芽孢杆菌管理现状 没有蜡样芽胞杆菌限量标准。婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌 采样时间：2014年5月-8月间 采样地点：北京婴幼儿用品店、超市 品牌：5个国内品牌，14个国外品牌，不同批次 17份国产样品，51份国外品牌样品，共计68份样品 选择性培养、BD Phoenix-100、PCR方法、MPN方法 对其中的蜡样芽胞杆菌进行了分离鉴定 北京市售婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的分离鉴定北京市售婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的分离鉴定 婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌 北京市售婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的分离鉴定北京市售婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的分离鉴定 分离得到分离得到88株蜡样芽胞杆菌，国内品牌的检出率为株蜡样芽胞杆菌，国内品牌的检出率为70.6%，平均污染，平均污染量量为为1.17MPN/g，国外品牌为，国外品牌为52.9%，平均，平均污染量污染量为为3.52 MPN/g。婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌 北京市售婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的毒力基因检测北京市售婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的毒力基因检测 溶血性肠毒素溶血性肠毒素HBL，非溶血性肠毒素，非溶血性肠毒素NHE、肠毒素、肠毒素K，其中，其中HBL和和NHE是引起腹泻的重要肠毒素，是引起腹泻的重要肠毒素，ces与呕吐有关。与呕吐有关。婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌 北京市售婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的毒力基因检测北京市售婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的毒力基因检测 毒力基因检测结果表明，13株分离株中未检出毒力基因，分离菌株中nhe基因的携带率最高，其中nheC的携带率为84.1%；hblA,hblC 和 hblD 的 携带率分别为5.68%,9.09%and 5.68%；仅有3株菌中检出ces；47株分离株同时携带nheA、nheB和nheC基因；4株分离株同时携带hblA,hblC 和 hblD；同时携带3种nhe基因成份和hbl基因成分的菌株有4株。婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌 北京市售婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的毒力基因检测北京市售婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的毒力基因检测 在分离菌株中共发现24种毒力基因模式；3株分离株同时携带所有检测的毒力基因，提示这3株菌可能会引发较为严重的中毒症状。婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌 北京市售婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的药物敏感性检测北京市售婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的药物敏感性检测 采用采用CLSI 标准标准M45-a2，对对9种抗生素敏感性进行了检测种抗生素敏感性进行了检测 婴幼儿配方粉中蜡样芽孢杆菌婴幼儿配方粉中蜡样芽孢杆菌 蜡样芽胞杆菌能够产生内酰胺酶，大量的研究表明，蜡样芽胞杆菌对酰胺类抗生素表现出耐药；对9种抗生素敏感性进行了检测，包括治疗蜡样的推荐药物，其中分离菌株对庆大霉素、阿米卡星和环丙沙星表现出100%敏感性；利福平敏感率低，为13.6%；7株分离株表现出对四环素和利福平双重耐药。北京市售婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的药物敏感性检测北京市售婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的药物敏感性检测 婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌 婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌储存过程中消长规律研究婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌储存过程中消长规律研究 婴幼儿婴幼儿配方奶粉中蜡样芽孢杆菌在室温条件下配方奶粉中蜡样芽孢杆菌在室温条件下的的生长趋势生长趋势 模拟乳粉开口后在存储消费期间室温条件下 蜡样芽胞杆菌的消长规律；随着时间的延长，蜡样芽孢杆菌的生长活力很快减退，第6天后，直接检测不能检测到蜡样芽孢杆菌，但通过前增菌后仍然能检测到蜡样芽胞杆菌。婴幼儿配方粉中蜡样芽孢杆菌婴幼儿配方粉中蜡样芽孢杆菌 婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌储存过程中消长规律研究婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌储存过程中消长规律研究 蜡蜡样芽孢样芽孢杆菌杆菌实时荧光实时荧光PCR检测结果检测结果 0-4天时，样品中蜡样芽胞杆菌的荧光PCR检测结果为阳性，随着时间的延长，5-6天后蜡样芽孢杆菌的检测结果有翘尾现象，判断为可疑，第6天后，不能检出蜡样芽孢杆菌。婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌 婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌储存过程中消长规律研究婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌储存过程中消长规律研究 通过对乳粉开口消费后在存储期间蜡样芽孢杆菌污染模拟实验，表明在室温条件下，随着时间的延长，蜡样芽孢杆菌的生长活力很快减退；第六天后，直接检测不能检出蜡样芽孢杆菌，但通过前增菌后，仍然可以检出蜡样芽孢杆菌；实时荧光PCR检测结果与国标检测方法一致，六天之后，增菌后乳粉样品中蜡样芽孢杆菌的MPN值为5.6CFU/g，分析原因可能是乳粉水分活度较低，抑制了蜡样芽孢杆菌的生长；低水分活度和密闭条件能够抑制蜡样芽胞杆菌的生长，在存储期内应防止乳粉受潮。婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌 复复水后婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的消长规律研究水后婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的消长规律研究 乳粉冲调后乳粉冲调后10CFU/g蜡蜡样芽孢杆菌样芽孢杆菌在在冷藏冷藏条件条件下下的的生长趋势生长趋势 取未检出蜡样芽孢杆菌的乳粉样品，冲调后接入10 CFU/g的蜡样芽胞杆菌，冷藏条件（4 C）下存储，蜡样芽孢杆菌能够在其中生长，但增长趋势不明显，存放12 h后MPN值为14 CFU/g。婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌 复复水后婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的消长规律研究水后婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的消长规律研究 乳粉冲调后乳粉冲调后10 CFU/g蜡蜡样芽孢杆菌在室温条件样芽孢杆菌在室温条件下下的的生长趋势生长趋势 取未检出蜡样芽孢杆菌的乳粉样品，冲调后接入10 CFU/g的蜡样芽胞杆菌，室温条件（25 C）下存储，蜡样芽孢杆菌能够在其中生长，但增长趋势较冷藏时快，存放10 h后MPN值为16 CFU/g。婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌 复复水后婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的消长规律研究水后婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的消长规律研究 乳粉冲调后乳粉冲调后10 CFU/g蜡蜡样芽孢杆菌样芽孢杆菌在在保温保温条件条件下下的的生长趋势生长趋势 取未检出蜡样芽孢杆菌的乳粉样品，冲调后接入10 CFU/g的蜡样芽胞杆菌，保温条件（37 C）下存储，蜡样芽孢杆菌能够在其中生长，存放8 h后MPN值为18 CFU/g。婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌 复复水后婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的消长规律研究水后婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的消长规律研究 综合比较3个生长模型的相关系数（R2）、均方误差（MSE）、偏差因子（Bf）和准确因子（Af）等拟合参数，修正Gompertz最优，因此，选择修正Gompertz拟合出的一级模型参数，建立生长参数随温度变化的二级模型。婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌 复复水后婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的消长规律研究水后婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的消长规律研究 乳粉冲乳粉冲调后调后蜡蜡样芽胞杆菌的二级模型样芽胞杆菌的二级模型（生长速率）（生长速率）放置于25 C-48 C不同恒定温度下的蜡样芽孢杆菌均可生长，最大比生长速率随着试验温度的升高先增加后减小，说明温度是影响蜡样芽孢杆菌生长的主要因素之一。最大比生长速率-温度模型的相关系数R2的值为0.9414，均方误差MSE值为0.0890，表明模型可以很好的拟合不同温度下蜡样芽孢杆菌的最大比生长速率，而且模型的拟合误差较小。复复水后婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的消长规律研究水后婴幼儿配方粉中蜡样芽胞杆菌的消长规律研究 婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌婴幼儿配方粉中的蜡样芽孢杆菌 蜡样芽胞杆菌可以在冲调后的乳粉中生长；存储温度不同，生长速率不同，随着温度的升高，生长速率呈现加快的趋势；乳粉中蜡样芽胞杆菌的初始污染菌量与其安全性相关，初始菌量100CFU/g时，冲调后存储温度越高导致疾病发生的概率越大。配方粉中的蜡样芽孢杆菌的风险配方粉中的蜡样芽孢杆菌的风险 以下做法可促使蜡样芽孢杆菌在冲调后的配方粉存储期间 快速生长 温水冲调后的配方粉在室温下储存；冲调后的配方粉在保温瓶中保温；含有不超过100 cfu/g蜡样芽孢杆菌的婴幼儿配方粉冲调后在4 C存储24 h,不会使婴幼儿暴露感染剂量的蜡样芽孢杆菌 用含有1000 cfu/g蜡样芽孢杆菌的配方粉冲调后在10 C存储24 h,食用后可能对婴幼儿造成风险