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新疆锁阳中总黄酮的提取工艺优化及含量测定【摘要】 目的优选新疆锁阳中总黄酮的提取工艺，比较不同产地新疆锁阳中总黄酮的含量。方法以总黄酮含量为指标，以芦丁为对照品, 用分光光度法比较了回流法、超声法、煎煮法从锁阳干燥肉质茎中提取黄酮类化合物的提取效率，采用正交表进行实验优化了超声法的提取工艺。比较了不同地区不同生长期的锁阳中总黄酮的含量。 结果固液比和超声时间对黄酮类化合物的提取效率有显着影响，乙醇浓度对提取效率影响不显着。结论最佳提取工艺为60%乙醇、1:60固液比、超声 h，且总黄酮含量以奇台地区的锁阳最高，出土期比开花期高，花中总黄酮含量高于茎中。【关键词】 锁阳； 黄酮类化合物； 最佳提取工艺； 超声Abstract：ObjectiveTo ascertain the optimum condition for extracting Cynomorium songaricumrutin as a comparison, we compared the extraction methods of the total flavones of Cynomorium songaricum Rupr., and studied the optimal conditions for extracting flavonoid compounds of Cynomorium songaricumusing L9 (34) orthogonal table, and compared the total flavone contents of Cynomorium songaricum Rupr. from different regions at different growthThe volume of alcohol and the time of extraction affected the total flavones significantly. ConclusionThe results showed that the highest extraction rate of the total flavones could be obtained with 60% ethanol solution at a ratio of solid to liquid 1:60 and ultrasoundh and the highest content of the total flavones is obtained from Qitai region at unearthed stage.Key words：Cynomorium songaricum Rupr.; Total flavones; The optimum extraction process; Ultrasound 锁阳Cynomorium songaricum Rupr., 又名不老药、铁棒槌、锈铁棒、地毛球、乌兰高腰(蒙语) 、锁严子， 是锁阳科Cynomoriaceae锁阳属的单科单属单种植物, 多寄生于蒺藜科(Zygophyllaceae) 白刺属(Nityaria L. )植物根部, 是全寄生种子植物。主要产于甘肃、新疆、青海、内蒙古等干旱沙漠地带。近年来，锁阳的保健价值已被广泛重视，化学成分被逐步揭示，而且对其生理、药理作用也有了更广泛的认识。目前，大量研究证明锁阳黄酮类化合物主要为儿茶素(Catechin)、柑桔素4-O-吡喃葡萄糖及一种以柑桔素为苷元的配糖体1。近几年研究表明，黄酮类化合物有明显的抗溃疡、抗菌、抗炎、降血脂等药用保健功能2；有防止动脉硬化或栓塞等效果，可作血管保护剂；对胸闷、心悸及早搏均有一定作用；对眩晕综合征、急性耳鸣、口臭等症状有防治功能3。作为天然来源的黄酮类化合物，能有效地清除自由基和脂质过氧化物，捕捉生物体内的超氧化物及过氧离子，切断生物体内导致人体衰老与病痛的脂质过氧化物连锁反应，螯合金属离子使之钝化， 防止脂肪氧化酶作用，从而具有抗衰老作用，是一种具有广泛开发前景的天然抗氧化剂35。 目前对锁阳中黄酮类化合物提取工艺及生理活性报道不多。我们利用不同方法浸提锁阳中黄酮类化合物，对锁阳中总黄酮类化合物的提取工艺作了系统的研究，为今后锁阳的综合开发利用提供科学依据。1 器材1 仪器S54紫外可见分光光度计；KQ3200型超声清洗器；SZ202型电热温度干燥箱；HH-S恒温水浴锅(江苏金坛县医疗仪器厂)。2 试剂芦丁对照品；乙醇；亚硝酸钠；氢氧化钠；硝酸铝。3 生药来源本课题所用药材分别采于2007年乌拉泊地区、奇台地区、昌吉地区未出土期、出土期、开花期的锁阳全草，品种由新疆医科大学生药教研室邢文斌老师鉴定。2 方法与结果标准溶液的制备 精密称取芦丁对照品2 mg，置于10 ml容量瓶中，加入50%乙醇适量，超声处理使之溶解，放冷，加50%乙醇水溶液至刻度，摇匀，为供试品储备液。测定波长的选择取芦丁对照品适量，在 ml 5%亚硝酸钠溶液存在的碱性条件下，经硝酸铝显色后，以试剂为空白参比液在420700 nm波长范围测定络合物的吸光度，络合物于510 nm波长处有最大吸收，故测定时选用此波长。标准曲线的制备 精密吸取， ml芦丁储备液，分别置于10 ml容量瓶中，先加入 ml 5%亚硝酸钠溶液，放置6 min后再加 ml10%硝酸铝，再放置6 min后加4 ml 4%氢氧化钠溶液，最后用50%的乙醇定容至10 ml，放置15 min后以试剂做空白在510 nm处测吸光度。其吸光度做线性回归，得芦丁含量与吸光度的回归方程为Y=，r= 6。方法学考察稳定性考察 取同一供试品在不同时间间隔测定吸光度，结果表明样品在50 min内稳定。重复性考察 精密称取锁阳粉末5份，每份 0 g，依法制备供试品，测定，计算总黄酮含量，RSD=%。精密度考察 取同一供试品溶液重复测定5次，计算其RSD=%。加样回收率实验精密称取已测知含量的锁阳样品9 份，分别加入相应量的对照品，按“供试品溶液制备”方法操作，测得平均回收率为% ，RSD=% 。提取工艺优化不同提取方法的比较 分别对回流法、超声法、煎煮法3种不同提取方法进行比较。具体操作 回流法：称定锁阳粉末约 0 g，以50%乙醇为溶剂50 ml回流提取 h，滤过，定容至50 ml容量瓶中，备用。 超声法：称定锁阳粉末约 0 g，以50%乙醇为溶剂50 ml，在室温下超声提取 h，滤过，定容至50 ml容量瓶中，备用。 煎煮法：称定锁阳粉末约 0 g,以水为溶剂，加50 ml水煎煮 h，滤过，定容至50 ml容量瓶中，备用。 准确吸取各样品溶液1 ml，置于10 ml容量瓶中，用50%乙醇定容，再精密吸取溶液1 ml，照“”项下的方法显色，测定吸光度，由线性回归方程计算样品中总黄酮的含量，以总黄酮的含量为指标。结果显示，超声法提取的总黄酮含量较高，故确定以超声法作为提取方法。正交实验单因素分析：根据文献报道，选择乙醇浓度，超声时间和固液比为考察对象，进行单因素分析：乙醇浓度的选择: 取锁阳粉末 0 g，分别取30%，50%，75%，85%，95%乙醇50 ml，在功率150 W，室温下进行超声提取30 min，测定计算总黄酮的含量,结果显示： 乙醇浓度为75%时总黄酮的含量最高。超声时间的选择: 取锁阳粉末 0 g，50% 乙醇50 ml，在功率150 W , 时间分别取10，30，60，90，120 min进行超声提取, 测定计算总黄酮的含量, 结果显示：超声时间为60 min时提取效率最高。固液比的选择: 取锁阳粉末 0 g，按固液比分别为120，130，140，150，160 (g/ml)加入50%的乙醇，在微波功率为150 W的条件下作用30 min,处理后计算黄酮含量。结果显示，固液比为140时总黄酮含量最高。 正交实验：由单因素考察的结果设置因素水平表，见表1。采用L9(34)正交表进行实验,见表23。表1 因素水平表2 L9(34)正交实验及结果表3 方差分析表从表2和表3可知, A，B，C 3个因素对锁阳中黄酮类化合物提取率的影响次序为A BC。固液比和超声时间对黄酮类化合物的提取效率有显着影响，所以固液比选择A3，超声时间选择B3。乙醇浓度对提取效率无显着性影响，从节约溶剂的角度来考虑，选择乙醇浓度为C1，提取的最佳工艺为A3B3C1。即乙醇浓度60%，固液比160，超声 h。验证实验取同一锁阳粉末3份，各约 0 g，用最佳工艺提取，采用“”项下方法测定，实验结果与正交实验基本一致，说明工艺稳定可行。样品中总黄酮的测定分别取不同地区，不同生长期的锁阳粉末 0 g，以60% 的乙醇水溶液为溶媒，固液比为160，超声 h，过滤，定容至100 ml容量瓶中，采用“”项下方法测定。结果见表4。 由表4可知，奇台地区的锁阳中总黄酮含量最高；且出土期总黄酮含量比其他生长期高；花中的总黄酮高于茎中。表4 不同地区、不同生长期的锁阳中总黄酮得率的测定“-”为未采集到样品，n=53 讨论 本实验比较了回流法、超声法、煎煮法3种提取方法对新疆锁阳中总黄酮的提取效率，以总黄酮得率为指标。结果显示超声法优于其他提取方法，而且此方法简便易行。进一步对超声法用正交实验优化提取工艺，实验结果表明，以60% 乙醇水溶液作为溶剂，固液比为160，超声 h，提取效果最好，可提高总黄酮提取得率，为锁阳中黄酮类化合物提取提供了一种新方法。 本实验还对乌拉泊地区、昌吉地区、奇台地区的未出土期、出土期、开花期的锁阳中总黄酮含量进行了比较。结果表明，不同地区出土期锁阳中总黄酮含量的高低次序为：奇台昌吉乌拉泊；不同生长期锁阳中总黄酮含量的高低次序为：未出土期出土期开花期；不同部位中总黄酮含量的高低次序为：花茎。 药物中如含有黄酮类成分，可用于定量分析的方法很多，主要有分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法等。本文采用分光光度法测定总黄酮含量，通过方法学考察，结果显示，该方法显色稳定，重复性、精密度及回收率均达到定量分析的方法学考察的要求，且简便易行。【参考文献】 1 齐艳华，苏格尔.锁阳的研究进展J.中草药,2000,31(2)：146. 2 杨 洋.生姜黄酮的提取及其抗氧化活性的研究J.食品科学，2002，23 (4)：45.3 王 放，王显伦.食品营养保健原理及技术M.北京: 中国轻工业出版社，1998：399,491.4 陈海光，余以刚，曾庆孝.荷叶黄酮及生物碱的提取研究J.食品科学, 2002, 23(1)：69.5 丁利君，吴振辉，蔡创海，等.金银花中黄酮类物质最佳提取工艺的研究J.食品科学,2002,23(2)：62.