方竹种质资源遗传多样性研究模板.doc
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1、资料内容仅供您学习参考,如有不当或者侵权,请联系改正或者删除。方竹和合江方竹种质遗传多样性研究刘跃钧基金项目: 丽水市重点科技合作项目( 计划编号: 4012) 作者简介: 刘跃钧( 1966-) , 男, 浙江松阳人, 教授级高工, 从事野生植物开发利用研究。; 陈世通2王立平3傅兵4( 1丽水市林业科学研究院, 浙江丽水323000; 2丽水九龙国家湿地公园管理处, 浙江丽水323000; 3遂昌县林业局, 浙江遂昌323300; 4丽水职业技术学院, 浙江丽水323000) 摘要: 目的建立及优化方竹和合江方竹的ISSR-PCR反应体系, 分析其12个种质资源的遗传多样性。方法采用L16
2、( 45) 正交试验建立、 优化ISSR-PCR反应体系, 利用该体系分析12个不同种源的方竹和合江方竹的遗传多样性。结果最佳ISSR-PCR的最佳体系为: MgCl22.5mmol/L、 dNTPs100mol/L、 Taq0.8U、 引物0.1mol/L、 DNA20ng、 1ReactionBuffer。12个供试竹种被分为两大类群, 其中除方竹遂昌种源2外的其它方竹竹种亲缘关系相当接近, 归为一个亚群; 合江方竹杭州种源和合江方竹莲都种源归到一个小亚群中。关键词: 方竹; 合江方竹; 分子标记, 遗传多样性; 研究寒竹属( ChimonobambusaMakino) 隶属于禾本科植物,
3、 其下有八月竹、 大明山方竹、 寒竹、 毛环方竹、 武夷山方竹、 永善方竹、 大叶方竹、 合江方竹、 云南方竹等20余种。中国拥有全部种类, 其主要分布在秦岭以南各省区, 比较集中的地区如四川、 贵州等西南各省区。表1寒竹属12种不同竹种采集地点种质代号种名种源种质采集地点1合江方竹丽水种源丽水市林科院百果园2合江方竹杭州种源浙江省林科院竹种园3方竹莲都种源1莲都区城西村4方竹莲都种源2莲都区大港头镇栋头村5方竹遂昌种源1遂昌县贵阳林场6方竹遂昌种源2遂昌县三仁乡林业站附近7方竹松阳种源1松阳县竹源乡小竹溪村8方竹松阳种源2松阳县三都乡9方竹松阳种源3松阳县竹源乡后畲村10方竹景宁种源景宁县东
4、坑镇杨斜村11方竹庆元种源庆元林场场部12方竹杭州种源浙江省林科院竹种园由于竹子是一类生物学特性特殊的植物, 以地下鞭延伸为主的无性繁殖方式, 以及开花时间、 空间上的不确定造成有性繁育系统的缺乏, 因此在亲缘关系鉴定, 遗传图谱的建立等方面都存在着很大的困难。ISSR1(intersamplesequencerepeat)分子标记由于不受环境及发育阶段的影响, 其技术已经越来越多的应用到竹类植物起源、 遗传多样性、 分类、 系统进化及构建遗传图谱等方面的研究。利用ISSR分子标记分析浙江省内合江方竹( Chejiangensis) 和方竹( C.quadrangularis) 不同种源之间的
5、的遗传多样性, 为今后优良竹种的选育等提供理论依据。1材料与方法1.1材料及来源于 10月采集浙江省内寒竹属12种不同的种质资源( 见表1) 。其中10种采自丽水地区各县( 市、 区) , 2种采自浙江省林业科学研究院竹种园。采得的鲜嫩竹叶后, 置于-80冰箱保存备用。1.2基因组DNA的提取用PlantDNAMiniKit试剂盒( OMEGA公司) 抽提叶片组织的基因组DNA。利用琼脂糖胶电泳检测基因组DNA的大小及完整性, 并用UV-2802S(上海洪富仪器仪表有限公司)测定基因组DNA的浓度和质量。1.3ISSR-PCR反应条件及程序影响PCR结果的因素主要为: 引物、 TaqDNA聚合
6、酶、 dNTPs、 模板DNA、 Mg2+, 借鉴杨本超2、 王涛3的反应体系及参数, 设计5因素4水平正交试验( 表2) 并利用正交实验进行适当优化。另外, 前期的研究发现, 反应体系中加入2%(v/v)去离子甲酰胺, 1%(v/v)甘油, 可提高PCR反应的特异性, 同时使条带清晰。本研究的ISSR-PCR反应程序初步确认为: 95预变性5min; 然后95变性45s, 50(退火温度随引物不同而变化)退火1min30s, 72延伸1min30s, 重复30个循环; 最后为72延伸10min, 4保存。表2ISSR-PCR正交设计表编号No因素和水平FactorandlevelMgCl2(
7、mmol/L)dNTPs(mol/L)Taq/U引物(mol/L)DNA/ng11.01000.20.11021.02000.40.22031.03000.60.33041.04000.80.44051.51000.40.34061.52000.20.43071.53000.80.12081.54000.60.21092.01000.60.420102.02000.80.310112.03000.20.240122.04000.40.130132.51000.80.230142.52000.60.140152.53000.40.410162.54000.20.3201.4ISSR引物的筛选参照
8、加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的第9套ISSR引物序列合成所用的ISSR引物, 共60条( UBC821-880) , 引物由北京全式金生物技术有限公司合成。以浙江省林科院竹种园合江方竹基因组DNA为模板, 进行引物筛选。1.5电泳及染色将筛选得到的引物分别以所有供试竹种基因组DNA为模板进行PCR反应。待反应结束后, 进行3.5%聚丙烯酰胺凝胶( EB染色) 电泳。用Dolphin-DOC+凝胶成像系统(Wealtec)进行分析, 并记录数据。DNA标准分子量为MarkerIII(北京全式金生物技术有限公司)。1.6数据处理和统计方法用Dolphin-DOC+凝胶成像系统自带软件结合人工方
9、法读带, ISSR扩增电泳图谱的每一条清晰且能重复出现的带, 均为一个分子标记(marker), 代表一个引物结合位点。在相同的迁移位置上, 有带用1表示, 无带用0表示。采用NTSYS-pc2.10e分析软件计算样品间的遗传相似性系数, 同时用UPGMA(unweightedpair-groupmethodanalysis)进行聚类分析, 构建聚类图。2结果2.1正交试验表3正交试验分析表编号MgCl2dNTPsTaq引物DNAk14.758.53.56.555k236.03.753.56k34.52.7545.54.5k47.151.758.253.753R4.156.254.753.05
10、3按照清晰度、 重复性及条带多少等遗传多样性的分析要求进行评分, 最佳组合记16分, 最差组合记1分。根据分数的不同求出每个因素水平下的平均值ki以及同一因素不同水平间的平均值的极差R。根据表4分析结果, 能够得出各因素对寒竹属竹子ISSR-PCR反应影响大小顺序为: dNTPsTaqMgCl2引物DNA。正交试验的统计分析结果( 表3) 与电泳结果( 图1) 对比显示, 统计分析结果与第13组体系比较接近, 在引物及DNA的用量上稍有差异。其中, DNA用量、 引物浓度分别在20ng及0.1mol/L时ki最高, 反应水平最高。引物浓度与扩增产物的质量有一定的关系, 引物过少扩增量不足, 浓
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