柑橘DNA和RNA提取方法.docx

1、 CTAB法提取柑橘DNA参考自：程运江. 柑橘体细胞胞质遗传及叶绿体SSR引物开发研究D.华中农业大学, 2004.实验准备工作：1 所用离心管、枪头要洗净、烘干（最好灭菌）。2 试剂配制：1 M Tris-HCl (pH 8.0): 称取Tris-Base 121g, 加入约800 ml 水在磁力搅拌器上搅拌，使其充分溶解后加入浓盐酸调整pH至8.0后加水定溶至1000 ml. 灭菌后于室温保存。0.5 M EDTA (pH 8.0): 称取EDTA-Na2盐 187 g 加入约 800 ml水，在磁力搅拌器上边搅拌边加入固体NaOH，当EDTA和NaOH均完全溶解，溶液变清时其pH值刚好达到8.0左右，再用pH试纸略加调整即可, 灭菌后于室温保存。5.0 M NaCl: 称取NaCl 300 g, 加入蒸馏水约800 ml 于磁力搅拌器上充分搅拌，约5分钟后停止搅拌，静止23分钟，倒出上清液，再加入100 ml蒸馏水重复前面的步骤，直到NaCl充分溶解后定溶至1000 ml., 灭菌后于室温保存。酚：氯仿：异戍醇（25：24：1）的配制：250ml Tris-饱和酚+240ml氯仿+10ml异戊醇，充分混合，静止分层（一般为过夜），就可使用，配好之后放4冰箱保存。氯仿：异戊醇（24:1）：240ml氯仿+10ml异戊醇 76%乙醇+10mM NH4Ac：380ml无水乙醇+120ml无菌水+0.385g NH4AcTE ：200ml无菌水+2l 1MTris-Hcl+0.4l 0.5M EDTA水饱和乙醚：乙醚中加入无菌水，混合，分层后可使用。DNA Buffer的配制：1 M Tris-HCl (pH 8.0)100 ml0.5 M EDTA (pH 8.0):100 ml5.0 M NaCl:300 mlH2O500 ml灭菌后于室温下保存3个月左右，用时按1.5%往Buffer中加入CTAB，在电炉上烧开；在通风橱里加入1%的巯基乙醇( 现配现用)。DNA的提取：1 取3 g叶片或愈伤组织，加入适量液氮研碎，转入预冷的50ml离心管，加入20 ml DNA提取缓冲液充分摇匀，于65 水浴6090 min，中途轻轻摇匀两次。2 加入15 ml 氯仿：异戍醇（24：1）轻轻摇匀10分钟，于BECKMAN离心机中4000 rpm离心15分钟。3 取上清液于另一50 ml离心管加入10 ml 氯仿：异戍醇（24：1）重复步骤2。4 吸上清液于一干净的50 ml 离心管，加入15 ml 冷冻的异丙醇，轻轻摇匀后于-20冷冻半小时，4000 rpm离心10分钟。弃上清液，加入5 ml 76%的乙醇（含10 mM NH4Ac）浸泡5 h（或过夜），中途换乙醇2-3次。5 弃乙醇风干沉淀约半小时，加入3.0 ml TE缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0；1 mM EDTA , pH 8.0），20 l RNase A（10 mg/ml），37 温浴过夜。6 溶液转入一10 ml离心管，加入3.0 ml苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）充分颠倒混匀，4000 rpm离心15 min，吸上清液于另一10 ml的离心管中，（一般不重复）。7 加入1 ml 5.0 M的NaCl和3.0 ml水饱和乙醚，充分混匀，4000 rpm离心5 min。8 弃乙醚，用20 l枪头挡住离心管管口内侧，用力下压枪头，使枪头与管壁间形成一狭缝，让下清液从缝中流入另一10 ml离心管。【去除果胶】9 加入5 ml冷冻的异丙醇，轻轻摇匀后于-20 冷冻半小时，4000 rpm离心10分钟。弃上清液，加入3 ml 70%的乙醇浸泡46 h（或过夜），中途换乙醇2-3次。风干乙醇，加入500 l TE溶解，或浸在乙醇中长期保存。DNA检测1 取DNA原液15 l稀释至3.0 ml，用UV-1601型紫外分光光度计测定230 nm、 260 nm及280 nm的吸光值。高质量的DNA要求：A260/A2302.0； 1.7A260/A2801.92 将DNA原液适当稀释后，用1 TAE，0.8%琼脂糖凝胶120V电泳30min进行质量检测。2、 CTAB法微量提取柑橘DNA参考自：程运江. 柑橘体细胞胞质遗传及叶绿体SSR引物开发研究D.华中农业大学, 2004.DNA的粗提1） 取0.1g叶片研磨，研细后加入600l CTAB提取液，再摇晃使其悬浮均匀2） 在65水浴锅中温浴60-90分钟，隔30分钟取出上下轻轻颠倒几次3） 水浴之后，加入700l苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下晃动10分钟以上，使之充分混匀，然后12000rpm离心10分钟4） 吸取上清液转至另一离心管中，加入60l 5M NaCl，再加入-20冰冻无水乙醇1ml，轻轻颠倒数次，混合均匀后冰冻30分钟沉淀DNA5） 10000rpm离心5分钟，弃上清液6） 加入1 ml 70%酒精浸泡2小时或过夜，8000rpm离心5分钟,弃酒精之后在工作台上风干DNA，注意不要过干，否则会使以后溶解困难。DNA检测:分光光度计检测D260/D280的比值：在1.8-2.0的范围内认为纯度较高上述方法提取的DNA比值在1.65-1.95之间。浓度=30000xOD260（DNA样品为5l时）。3.柑橘组织的RNA的粗提与纯化参考自：刘永忠. 脐橙（Citrus sinensis Osbeck）晚熟芽变性状形成机理研究D.华中农业大学, 2006.(一) 试剂准备（在通风橱中进行）1）DEPC水的配制实验所需要的DEPC水的浓度为0.01%-0.05%。用双蒸水配制，搅拌过夜，在通风橱中加水和DEPC，用5L小口罐子。配制的DEPC水可用来浸泡耗材，分装后拿去高压灭菌待用。2）Buffer溶液的配制（以500ml为例）（测序所用的buffer一般要新配的）（不灭菌）1. 按顺序加入以下药品：异硫氰酸胍 59.08g（一次性杯子装）硫氰酸胺 38.06g（一次性杯子装）水饱和酚（PH=5.2） 190ml（大量筒要润洗）3M醋酸钠 16.7ml（枪吸取）甘油 25ml（玻璃量筒，要润洗）1%8-羟基喹啉 0.5g2.用DEPC水定容至500ml。摇匀，黑袋子避光保存，置于4冰箱3）Bu/CTAB 和AQ/CTAB的配制（不用灭菌）混合200mlBu（正丁醇）与200mlDEPC水（AQ）,充分摇匀静置4h使其分层，吸取上层100ml装入一个DEPC处理且灭菌的瓶子里，下次吸取100ml装入另外一个瓶子，向装上层的瓶子中以每50ml水饱和Bu加1.84gCTAB，100ml就加3.68g CTAB.剧烈震荡充分溶解后，再向该瓶中加100ml的下层（Aq）,充分震荡静置过夜，然后分层分瓶装，上层Bu/CTAB，下层叫AQ/CTAB。分层后将其分别存放。4）TESAR溶液配制（不能灭菌，用DEPC水配好就可以用）母液浓度终浓度 100mlTris-HCL (ph=7.6) 1M 10Mm 1mlEDTA 0.5M 1Mm200lSarcosyl 10%1%10ml 5）NaAC(醋酸钠配制)（80ml）称取32.66gNaAC.3H2O 于100ml瓶中，加入约40ml的未灭菌的DEPC水搅拌，用冰醋酸调PH至5.2，定容至80ml,高压灭菌。6）Sarcosyl(十二烷基肌氨酸钠)10%: 10g Sarcosyl+100ml未灭菌的DEPC水后灭菌。7）0.2MNacl：1.17gNacl+100ml未灭菌的DEPC水配好后灭菌。8)10倍MOPS（1L）（不能灭菌）：20.93gMOPS，10.88gNaAC.3H2O，1.68g EDTA，加DEPC水定容至1L，10MNaOH（灭菌DEPC水配）调pH值至7.0。9)1M tris-Hcl(不能灭菌)：称取12.1g，加入80ml灭菌的DEPC.H2O，溶解后加入浓盐酸调PH值7.6，定容至100ml。（只能用灭过菌的DEPC.H2O配） (10) 0.5M EDTA:称取EDTA Na2盐18.7g加入约80ml 未处理DEPCH2O，边搅拌边加入固体NaOH, 当溶液变清时即可，调节PH=8，灭菌后室温保存。（二）提取过程（以中量法为例，及可做转录组）粗提：1） 向10ml离心管中加5ml Trizol Buffer，在通风橱中加好后，再磨样。2） 向Trizol Buffer中加入0.5g左右研磨好的果皮（叶片约0.1-0.3g，果肉1g）样品。3）剧烈震荡混匀(2-3min)，室温下静置15min。4）每管加入2ml（或者2.5ml）氯仿，充分震荡15-30s后(太剧烈会使DNA断裂)，室温静置10min。(分三层，上为水相，中为DNA,下为杂质)并且开始4预冷离心机。5）4，10000rpm离心15min，取上清至另一离心管中。6）可适当重复4-5步（一般不做重复）。7）加入等体积的预冷异丙醇，轻轻混匀（一定要混匀）。8）静置5-10min。9）4，10000rpm离心20min。10）弃上清，加预冷的75%乙醇浸泡1h（过夜不太好）。（需要涡旋1min）11）4，12000rpm轻甩2min。12）弃乙醇，风干。（不用风干或风干2-3min，小于3min，不要过于干燥）纯化：在纯化过程中经常换手套，因为都是在超净台上完成，需要保持干净。1）向沉淀中加入800lTESAR，涡旋至沉淀充分溶解（5min以上）。2）分别加入800lAQ/CTAB和800lBu/CTAB（先AQ/CTAB），涡旋10min。（CTAB倾向于结合Bu，RNA与CTAB结合留在Bu（上清）中，果胶和多糖留在水中。3）将混合液转入两个1.5ml离心管中。4）室温下最大转速（13200r即可）离心6min。5）将两个离心管中的上清液转入同一新的1.5ml离心管中。6）加350l 0.2mol/L NaCl涡旋1min，室温最大转速离(13200r)心5min。7）小心吸取下清液转入同一新的1.5ml离心管。加入50l 3mol/L NaAC和1ml预冷乙醇，轻轻混匀，置于-20冰冻1h。8）4最大转速离心30min，弃上清，风干。9）加入25l DEPC水溶解。10）检测。1.胶检（一方面检测是否有DNA污染，另一方面检测三条带是否完整）。1.2%-1.5%的胶浓度(浓度高一点比较好，容易变硬)（取TEA溶液30ml，胶取0.4g），称胶溶解，加核酸染料，冷却8-10min后上样，保证点样孔800-1000ngRNA即可。然后跑胶90-100V/20-25min（电压太高不好）即可，关掉电泳仪，照胶后，将制胶板还回相应位置，因为照胶板实经过DEPC水处理过的。高质量的RNA胶检要求，在点样孔下方，RNA三条带上方无RNA带；28S，18S，5S带完整，且28S最亮，18S是28S亮度的一半，5S的亮度是18S的一半，即靠近点样孔的两条带最亮，而5S最暗，如果5S带亮说明分解很明显；点样孔无亮点，说明无蛋白污染。