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环境中微生物的检测和分离纯化
一、实验目的：
1.熟悉常用微生物培养基的配制方法。
2.学习并掌握各种无菌操作技术，并用此技术进行微生物稀释分离、划线分离接种。
3.用平板划线法和稀释法分离微生物。
4.认识微生物存在的普遍性，体会无菌操作的重要性。

二、实验原理：
（一）微生物的分离与纯化：
土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此，土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离和纯化。常用的是平板分离法。为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、温度和氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某些抑制剂，造成抑制其他菌生长而利于此菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物。再用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离，纯化该微生物，直至得到纯菌种。
（二）平板菌落计数法：
平板菌落计数法是将样品经适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品含菌数。
此法缺陷：操作繁琐，结果需要培养一段时间才能取得，测定结果易受多种因素的影响。
此法优点：可以获得活菌的信息，被广泛用于生物制品检验，以及食品、饮料和水等的含菌指数或污染程度的检测。

三、实验材料和仪器：
土样10g，未知菌变形杆菌单菌落平板和无菌水。
取液器（5000ul、1000ul各一支），培养箱，培养皿（20个），无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，5000ul、1000ul无菌吸头，记号笔，酒精灯，火柴，试管架。

四、实验步骤：
（一）培养基的制备（第二次实验时准备）：
肉汤蛋白胨培养基：
牛肉膏 2g
蛋白胨 4g
NaCl 2g
蒸馏水 400mL
琼脂 8g
1. 称量：按上述配方称量各类物质。
2. 溶解：在400mL水中溶解牛肉膏、蛋白胨和NaCl，混合加热溶解。
3. 调pH值：调至7.2-7.6
4. 加凝固剂：加入称量好的琼脂，混合均匀。
5. 分装、包扎和灭菌、倒平板。

（二）稀释法分离土壤中微生物：
1. 采土样（助教完成）：
选择肥沃土壤,去表层土,挖5~20cm深度的土壤数10g,装入烧杯,带回实验室。
2. 制备土壤稀释液（助教完成）：土样1.0g，无菌水99ml，振荡5min成为土壤悬液（10-2）。
3. 配置不同浓度的土壤稀释液：取100ul土壤悬液于已装0.9ml无菌水的ep管，吹吸三次，摇匀（10-3）类推制得10-4、10-5 、10-6的土壤悬液。（精确稀释）
4. 涂布：用无菌吸头，分别吸取10-4、10-5、10-6浓度土壤稀释液100ul，较均匀地放入已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上，用无菌玻璃棒涂匀。每个浓度做3个平板。
5. 培养：将牛肉蛋白胨培养基平板倒置于340C温箱中培养24h；统计所长出的菌落数。
6. 菌落计数：数出同一稀释浓度三个平板上的菌落平均数，换算出土样中的菌含量。
土壤中的细菌含量（个/g土壤）=同一稀释浓度3个平板平均菌落数×稀释倍数/0.1
说明：
1. 有较大片菌苔生长时，弃用，以无大片菌苔生长的培养皿计数；若成片菌苔大小不到培养皿的一半，其余一半分布均匀，将此一半计数×2。
2. 选择平均菌落数在30~300间的平板。只有一个浓度符合此范围时，以该平均菌落数乘稀释倍数即为样品中的菌总数；有两个浓度的菌落数在30~300间时，按两者菌总数比值决定：比值小于2，取平均；比值大于2，取较少的菌落总数。
3. 所有菌落数均大于300，取稀释倍数最高的平均菌落数乘菌落总数；所有菌落总数均小于30，取稀释倍数最低的平均菌落数乘稀释倍数。所有菌落数均不在30~300间时，以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数。

（三）划线法分离单菌落：
取一个平板，分区，用接种环取未知菌种，在平板上划线。划完一边后，灼烧接种环，冷却后从上次划线的末端朝另一个方向划线。以此类推，划完各个方向。

（四）周围环境中微生物的检测：
1. 取一个平板，置于试验台空气中11min。
2. 取一个平板，打开皿盖，对着培养基咳嗽。
3. 用无菌牙签取一点牙垢在培养基上划线。
4. 取0.1ml饮用水进行涂布。
5. 将一个平板分成三个区域，分别用未洗过的手指，用水冲过的手指，以及用蓝月亮洗液仔细洗过的手指在其上涂抹。
6. 用100元钞票在培养基上涂抹。

五、实验结果：
1. 土壤中的微生物平板计数结果：
平板号
不同稀释浓度的平均菌落数
两个稀释度菌落数之比
菌落总数（个/ml）
10-4
10-5
10-6
1
无法计数
无法计数
0
---
----
2
无法计数
无法计数
0
---
-----
3
70
30
0
4.3
7.0×106
备注：由于菌落都连成一片，无法去数，故只能先由分散的单菌落估算出每个菌落的大小，而后再根据整个菌斑的面积大致推算出培养基上的菌落数。所以，推算出的结果误差较大。

稀释浓度10-4

稀释浓度10-5

稀释浓度10-6

2. 划线法分离单菌落：
存在单菌落

存在单菌落

效果不理想

效果不理想

3. 周围环境中微生物的检测：
1）暴露在空气中11min：
没有菌落，说明空气中的细菌并不十分容易污染培养基

2）喷嚏：
没有菌落，可能是因为没有多少唾液喷进去

3）手指（未洗、水冲一次、用蓝月亮洗液清洗）：
用蓝月亮洗液仔细清洗
用水冲洗一次
未洗

4）饮用水：
满是菌落，说明饮用水中存在大量细菌

5）牙垢：
没有菌落，可能是取样存在问题

6）纸币：
没有菌落，可能是细菌不易从纸币上剥落

六、实验讨论及小结：
1. 我们组最后推算出土壤中菌的总数量在107这个数量级上，与老师所讲的理论值大致相符。然而，正如之前所说，由于培养基上的菌落生长情况很不理想（出现大菌斑或没有），因此我们无法去准确的数出培养基上的菌落总数，只能根据单菌落的平均大小和菌斑的面积大致估算出一个菌落总数。而且，尽管采用了这种很不精确的方法，我们也只能得到两个可用于计算的数值。所以，我们的实验结果存在非常大的误差，没有什么实际的意义。导致上述情况出现的原因我想可能主要还是涂布不均。一开始，我们用玻璃涂棒的方法存在问题，在老师的指导下，才改正过来。因此开始几个平板上的细菌大多都粘在了玻璃涂棒上，致使培养基上几乎没有菌落长出。改正之后，可能是涂布时间不够，或是用力不均，总之细菌并没有均匀的散开，结果使得培养基上长出大的菌斑，给计数造成不便。下次操作时，我觉得可以分散的滴加菌液，同时适当延长涂布时间，并将培养皿放在一个平台上，使其均匀散开。
2. 我认为无菌操作应注意以下几点：
1）始终在酒精灯火焰旁操作。
2）始终用无菌材料与样品直接接触。
3）培养皿开口应尽量小，时间应尽量短。
3. 饭前洗手，饭后刷牙的重要性：
由实验结果知：用水冲洗一次后，手指上的细菌大幅减少。因此，饭前洗手是很有必要的，可以有效降低“病从口入”的风险。小孩抵抗力较弱，更应注意。另外，饭后许多食物残渣在口腔中堆积，如不及时刷牙，会滋生细菌，对健康不利。因此，我们应该养成饭后刷牙或是漱口的好习惯。
4. 在日常生活中如何讲究饮食卫生？
我觉得首先食材要洗净，这不仅是为了去除一些细菌，更主要是为了洗去农药等有害的化学药品残留。其次，最好食物要有一个高温处理的过程，这样可以杀灭虫卵，并在一定程度上减少细菌，对我们的健康有利。除此之外，剩余的食物应放在冰箱中低温保存，这样可以降低细菌等微生物的生长速度，延长食物的保质期限。
5. 试解释夏天时煮好的饭如果放在锅中保持盖着锅盖不动，不容易变质，而一旦盛在碗里的饭就容易变质，如果是吃剩的剩饭就最容易变质的原因。
答：煮饭的过程其实在一定程度上也是一个灭菌的过程，因此，如果煮好的饭放在锅中并保持锅盖不动，则不易变质。如果将饭盛在碗中，则腕上和空气中的细菌则有机会和米饭接触，又因为夏天温度较高，细菌繁殖较快，因此米饭容易变质。如果米饭是被人吃过的，则人口腔中的细菌更是直接转移到了米饭上，因此吃剩的米饭最易变质。
6. 根据实验结果，试批驳“洁癖行为”。
答：由实验结果可知：我们生活的环境中，微生物无处不在。如我们平时喝的饮用水中就存在大量的细菌。然而，人体的免疫系统是非常强大的，因此，我们虽然每时每刻都在被细菌、病毒等微生物侵染，但多数情况下还是能够健康的生活。所以，“洁癖行为”其实是没有必要的。另外，过分洁癖，不仅浪费时间和精力，有时还根本起不到什么实际作用。如试验中用蓝月亮洗液仔细洗手，和只冲洗一次，测出的微生物数量几乎没有变化。可见，有时“洁癖行为”只能使人在心理上得到满足，并不能真正使自己生活的更加卫生。

七、参考文献：
陈金春、陈国强，微生物学实验指导，清华大学出版社，2005