分子生物学简答题.doc

课后思考题1. 试述乳糖操纵子的结构及调控原理？乳糖操纵子开放转录需要什么条件？（1）乳糖操纵子的结构：含Z、Y、A3个结构基因，分别编码乳糖代谢的3个酶；一个操纵序列O，一个启动序列P，一个CAP结合位点共同构成乳糖操纵子的调控区。乳糖操纵子的上游还有一个调节基因I。 （2）阻遏蛋白的负性调节：I基因的表达产物为一种阻遏蛋白，在没有乳糖存在时，阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录启动，乳糖操作子处于阻遏状态；当有乳糖存在时，乳糖转变为半乳糖，后者结合阻遏蛋白，使构象变化，阻遏蛋白与O序列解离，在CAP蛋白协作下发生转录。 （3）CAP的正性调节：分解代谢基因激活蛋白（CAP）分子内存在DNA和cAMP结合位点。当没有葡萄糖时，cAMP浓度较高，cAMP与CAP结合，cAMP-CAP结合于CAP结合位点，提高RNA转录活性；当有葡萄糖时，cAMP浓度降低，cAMP与CAP结合受阻，乳糖操纵子表达下降。 （4）协调调节：乳糖操纵子阻遏蛋白的负性调节和CAP的正性调节机制协调合作，CAP不能激活被阻遏蛋白封闭基因的表达，但如果没有CAP存在来加强转录活性，即使阻遏蛋白从操纵序列上解离仍无转录活性。因此，乳糖操纵子开放转录需要的条件是：1）诱导物乳糖存在，解除阻遏蛋白的负调节。2）葡萄糖缺乏，CAP蛋白活化，启动正调节。2.试述原核生物和真核生物基因表达调控特点的异同。（1）相同点：转录起始是基因表达调控的关键环节。 （2）不同点：1）原核生物基因表达调控主要包括转录和翻译水平；真核基因表达调控包括染色质活化、转录、转录后加工、翻译、翻译后加工多个层次。2）原核基因表达调控主要为负调节；真核生物基因表达调控主要为正调节。3）原核转录起始不需要转录因子，RNA聚合酶直接结合启动子，由因子决定基因表达的特异性；真核转录起始需要基础、特异两类转录因子，依赖DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用，调控转录激活。4）原核基因表达调控主要采用操纵子模型，转录出多顺反子RNA，实现协调调节；真核基因转录产物为单顺反子RNA，功能相关蛋白质的协调表达机制更为复杂。4.简述真核生物基因表达调控的特点。（1）真核生物基因表达调控主要为正调节。（2）真核基因转录产物为单顺反子RNA，功能相关蛋白质的协调表达机制更为复杂。（3）真核生物基因表达调控具有典型的多级调控特点，包括染色质水平调控、转录调控、转录后调控、翻译调控等。（4）与基本调控点即转录起始密切相关的是染色质水平的调控和转录水平的调控。染色质水平的调控是真核基因转录起始调控的前提，染色质核小体中组蛋白的不同化学修饰组合可形成组蛋白密码，通过参与调节染色质重塑，改变染色质活性，DNA甲基化修饰通常抑制基因的转录活性。（5）转录起始是真核生物基因表达调控的最重要环节。真核生物RNA聚合酶对启动子的亲和力极小，必须依赖一种或多种转录因子的作用才能起始转录。调控作用主要是通过反式作用因子结合顺式作用元件后影响转录起始复合物的形成，影响RNA聚合酶的作用。顺式作用元件是调控转录起始的DNA序列，包括启动子、增强子、沉默子等，反式作用因子是能与序列特异DNA结合的蛋白，即转录因子，主要功能是使基因开放和关闭，从而影响转录。（6）转录后调控包括对mRNA的加工修饰、转运、细胞质定位以及稳定性等多方面的调控。翻译调控点主要在起始阶段和延长阶段，翻译起始因子的磷酸化可调节蛋白质翻译。另外，小分子RNA通过干扰翻译过程抑制基因表达。真核基因表达调控特点：1）既有瞬时调控，又有发育调控 2）调控环节更多 3）染色质结构变化影响转录效率 4）转录调控以正调控为主 5）调控元件复杂并且可以远离转录区 6）转录因子种类多，调控机制更复杂真核生物和原核生物基因结构的差异：1）原核生物的结构基因是连续的，RNA合成后不需要剪接加工；由外显子（编码序列)和内含子（非编码序列)两部分组成，编码序列不连续，称为断裂基因 2）真核生物的基因都是单顺反子；原核生物大多是多顺反子真核生物、原核生物、病毒基因组特点差异：1）病毒：所含核酸的种类与结构不同所含核酸的分子数不同基因组小基因组为单倍体并且所含基因为单拷贝基因组序列基本上都是编码序列基因的连续性不同相关基因串连成一个转录单位 2）原核：基因组DNA大多数为超螺旋结构的单一闭合双链分子基因组DNA只有一个复制起点基因组序列以编码序列为主基因组所含基因的数目比病毒多 3）真核：染色体DNA是线性分子染色体DNA形成染色体结构基因组序列中仅有不到10%是蛋白质编码序列基因在基因组中散在分布基因组序列中包含大量重复序列基因组中存在各种基因家族基因组中含大量转座子3.什么是诱导和阻遏？以乳糖和色氨酸操纵子为例，比较两种操纵子的结构及负调控方式的差异。在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为可诱导基因。可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导。如果基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏。乳糖和色氨酸操纵子相同之处：都是DNA序列，是转录的功能单位，由调节基因、启动子、操纵基因和结构基因组成。不同之处：乳糖操纵子是负控控诱导，色氨酸操纵子是负调控阻遏。乳糖操纵子是一个可诱导的操纵子。乳糖操纵子的调节基因编码阻遏蛋白，当无乳糖存在时，阻遏蛋白与操纵序列结合，阻止RNA聚合酶对结构基因的转录。当乳糖存在时，乳糖的分解产物半乳糖作为诱导剂与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构象改变，导致阻遏蛋白与操纵序列解离，诱导基因的转录。色氨酸操纵子主要受阻遏抑制调控，在细胞内无色氨酸时，阻遏蛋白不与操纵序列结合，转录开放；当色氨酸浓度较高时，色氨酸与阻遏蛋白形成复合物并结合到操纵序列上，关闭基因表达。5.简述胰高血糖素升血糖的信号转导路径（以PKA信号通路为例）。胰高血糖素升高血糖是由G蛋白偶联受体介导的。G蛋白偶联受体由一条多肽链构成，其肽链反复跨膜七次，膜内部分与G蛋白偶联。G蛋白是GTP结合蛋白，结合GTP时为活化形式，作用于下游分子，并开放相应信号途径；同时具有GTP酶活性，水解GTP为GDP时为非活化形式，使信号转导关闭。胰高血糖素和受体结合后激活G蛋白，使之构象发生改变。亚基与GDP的亲和力下降，结合的GDP被GTP取代，结合了GTP的亚基与亚基解离，进入活化状态。活化的亚基作用于下游的效应分子，这种活化状态将一直持续到GTP被亚基自身水解为GDP，又再次与亚基形成复合体，回到静止状态。活化的亚基将信号传递给腺苷酸环化酶AC，使AC活化，催化ATP生成小分子信使cAMP，cAMP又激活蛋白激酶A（PKA），PKA激活糖原磷酸化酶b激酶，促进糖原分解代谢；同时抑制糖原合酶，抑制糖原合成，从而使血糖升高。6. 列举G蛋白偶联受体介导的细胞信号转导通路。（1）cAMP-PKA通路。激素和受体结合后激活G蛋白，释放GTP结合形式的活化的亚基，亚基激活腺苷酸环化酶（AC）。AC催化产生小分子信使cAMP。cAMP结合PKA，通过变构调节作用激活PKA，PKA通过磷酸化作用激活或抑制各种效应蛋白，产生多种细胞效应。（2）IP3/DAG-PKC通路。此类信号转导通路中的细胞外信号分子结合受体激活G蛋白，释放活化的亚基，亚基激活PLC。PLC水解膜组分PIP2，生成DAG和IP3。IP3从膜上扩散到细胞质中，与内质网和肌浆网上的受体结合，促进这些钙储存库内的Ca2+迅速释放，使细胞质内的Ca2+浓度升高。Ca2+与细胞质内的PKC结合并聚集至质膜。DAG生成后仍留在质膜上，当结合有Ca2+的PKC聚集到质膜时，DAG、磷酯酰丝氨酸与Ca2+共同作用于PKC的调节结构域，使PKC变构而暴露出活性中心。PKC通过磷酸化作用激活各种功能蛋白质，调节物质代谢、基因表达等生理活动。（3）Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白质激酶通路。细胞质内Ca2+浓度升高后，Ca2+可与细胞质内的钙调节蛋白结合，形成具有调节功能的Ca2+/CaM复合物。Ca2+/CaM复合物的下游信号分子为钙调蛋白依赖性蛋白激酶。钙调蛋白依赖性激酶属于蛋白质丝/苏氨酸激酶，如肌球蛋白轻链激酶、磷酸化酶激酶、钙调蛋白依赖性激酶。这些激酶可激活各种效应蛋白质，在收缩和运动、物质代谢、神经递质的合成、细胞分泌和分裂等多种生理过程中发挥重要作用。7.简述G蛋白偶联受体介导的信号转导的基本模式。（1）细胞外信号分子结合受体，通过别构效应将其激活。（2）受体激活G蛋白，G蛋白在有活性和无活性状态之间连续转换，称为G蛋白循环。（3）活化的G蛋白激活下游效应分子。（4）G蛋白的效应分子向下游传递信号的主要方式是催化产生小分子信使。（5）小分子信使作用于相应的靶分子（主要是蛋白激酶），使之构象改变而激活。（6）蛋白激酶通过磷酸化作用激活一些与代谢相关的酶、与基因表达相关的转录因子以及一些与细胞运动相关的蛋白，从而产生各种细胞应答反应。8.列举第二信使分子的种类及其主要特点。第二信使分子的种类主要包括环腺苷酸（cAMP）、环鸟甘酸（cGMP）、甘油二酯（DAG）、三磷酸肌醇（IP3）、磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）、Ca2+、NO等。主要特点：（1）为细胞内具有信号转导功能的小分子化合物。（2）在完整细胞中，该分子的浓度或分布在外源信号的作用下发生迅速改变。（3）该分子类似物可模拟外源信号的作用。（4）阻断该分子的变化可阻断细胞对外源信号的反应。（5）该分子在细胞内有确定的靶分子。（6）可作为别位效应剂作用于靶分子。（7）在信号转导过程中的主要变化是浓度变化。PKA使丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化 PKC属于丝/苏氨酸蛋白激酶上游信号：腺苷酸环化酶 鸟苷酸环化酶常见第二信使：cAMP cGMP IP3 脂类 DAG Ca2+效应蛋白：蛋白激酶A PKG IP3门控钙通道 PKC PKC,钙调蛋白激酶9.请比较PCR反应和体内DNA复制过程的异同点。10.克隆载体一般具备哪些基本特性？ （1）具有自主复制起点，使载体在宿主细胞中进行自主复制，并能使克隆的外源DNA得到同步扩增；（2）至少有一个筛选标志；（3）有适宜的限制性核酸内切酶单一酶切位点，可供外源基因插入时选择。11.简述分子生物学实验中的互补和蓝白斑筛选的原理。 -半乳糖苷酶（-gal）的片段与受体菌编码的片段（lacZ-）可以互补结合发挥-gal的活性，称作互补。一些质粒上带有-半乳糖苷酶片段的编码序列LacZ，转化进入受体菌，可形成互补，即可催化底物X-gal产生蓝色产物，使菌落变蓝。由于这些质粒的多克隆位点位于LacZ内部，插入外源DNA片段后，使LacZ不能编码产生有功能的-gal的片段，不能发生互补，在X-gal存在下受体菌落呈白色。因此，蓝色菌落代表载体中LacZ基因活性完好无损，没有插入外源DNA片段，白色菌落则表明着所含质粒带有外源DNA片段，为重组质粒。用蓝白斑筛选可以来区分转化进入受体菌的是空载体还是重组质粒。12.试述重组DNA技术的基本步骤。 （1）分：目的DNA的分离获取；（2）选：载体的选择与构建；（3）接：目的DNA与载体连接；（4）转：重组DNA转入受体细胞；（5）筛：重组体的筛选与鉴定。13.以镰状细胞贫血病为例简述疾病发病分子机理，并介绍对其进行PCR-RFLP基因诊断的方法。镰状细胞贫血是一种常染色体显性遗传血红蛋白(Hb)病，属于分子病。正常成人血红蛋白是由两条链和两条链相互结合成的四聚体，链和链分别由141和146个氨基酸顺序连结构成。镰状细胞贫血患者因珠蛋白基因（HBS）发生第6密码子的错义突变（A变为T），使编码生成的链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸所代替，形成了异常的血红蛋白S（hemoglobin S，HbS），取代了正常血红蛋白（HbA），在氧分压下降时HbS分子间相互作用，成为溶解度很低的螺旋形多聚体，使红细胞扭曲成镰状细胞（镰变）造成贫血症状。HBS突变碱基位于限制性核酸内切酶Mst II位点（CC.TNAGG）中，突变（A变为T）导致该限制性酶切位点丢失，因此，可以设计镰状细胞贫血的PCR-RFLP诊断方法：PCR扩增HBB基因含第5/6/7密码子的片段（1.35kb），用Mst II充分消化扩增产物，再用琼脂糖凝胶电泳分析。正常人扩增产物显示1.15kb和0.20kb两条条带，镰状细胞贫血患者扩增产物则显示1.35kb单一条带，携带者则有1.35kb、1.15kb和0.20kb三条条带。14.简述基因治疗的几种策略和基本程序。基因治疗的策略包括：（1）缺陷基因精确的原位修复，包括对致病基因的突变碱基进行纠正的基因矫正和用正常基因通过重组原位替换致病基因的基因置换。属于精确修复，是最理想的治疗方法。（2）基因增补：不删除突变的致病基因，而在基因组中额外插入正常基因，在体内表达出功能正常的蛋白质，实现疾病的治疗。（3）基因沉默或失活：对于一些由于某些基因过度表达引起的疾病，向患者体内导入有抑制基因表达作用的核酸，降解相应的mRNA或抑制其翻译，实现疾病的治疗。基因治疗的基本程序：（1）选择治疗基因：根据疾病的治病基因，选择对应的正常基因或者经过改造的基因作为治疗基因。（2）选择基因载体：有病毒载体（临床上常用）和非病毒载体。（3）选择靶细胞：通常是体细胞，常用的如造血干细胞、皮肤成纤维细胞和肌细胞。（4）将治疗基因导入人体，分：间接体内疗法，将靶细胞从体内取出后进行基因导入，筛选出成功导入的细胞，繁殖扩大后再输回体内，使治疗基因在体内表达；直接体内疗法，是将外源基因直接注入体内有关的组织器官，使其进入相应细胞并表达。（5）治疗基因表达的检测：用PCR、RNA印迹、蛋白印迹及ELISA等方法检测导入的治疗基因是否被正取表达。15.谈谈你对基因异常和疾病发生之间关系的认识。（一）人类所有疾病均为视为基因病。（1）影响疾病发生发展的基因分为致病基因和疾病易感基因，统称为疾病相关基因。如果一种疾病的表型和一个基因型呈现直接对应的因果关系，该基因就属于致病基因，这类疾病主要是单基因病。复杂性疾病，如肿瘤、心血管疾病等，遗传因素表现为2个以上基因甚至多个基因间的相互作用，单一基因的变异仅增加对疾病的易感性，称为疾病易感基因。（2）基因与疾病并不总是简单对应的关系，一种基因可参与不同的疾病发病过程，不同基因的相互作用可参与同一种疾病的发病过程，表现出基因参与疾病发病机制的复杂性和异质性。（二）不同基因对疾病发生发展的影响程度不同：单基因疾病致病基因按表达产物蛋白质的功能，主要可分为14大类（酶、调节蛋白、受体、转录因子等），其中酶类基因在很多代谢过程中起到至关重要的作用，最为突出。（三）多种原因可导致不同类型的基因与基因组正常。（1）基因异常分为结构异常和表达异常，包括类型有：染色体数目和结构的异常、单个核苷酸的改变、多个核苷酸序列异常或基因拷贝数目的变化。基因与基因组结构的异常可发生在体细胞或生殖细胞中，可能在结构基因的编码区或非编码区。（2）基因异常的产生具有多种原因，包括自然条件下发生随机突变，同源重组，物理、化学和生物因素诱导的致病突变以及自然选择与遗传漂移等。引起突变的因素广泛存在于机体内外环境中，包括物理因素、化学因素和生物因素。（四）基因异常可导致表达产物的结构和功能的异常（质的改变）或是产物表达水平的异常（量的变化）而引起疾病。基因异常的生物学效应可区分为功能丧失和功能获得。导致产物表达水平异常有多种机制。增强子的功能及作用特征：1）与被调控基因位于同一条DNA链上，属于顺式作用元件2)是组织特异性转录因子的结合部位 3)能在基因的上游或下游起作用，还可远距离实施调节作用 3）作用与序列的方向性无关 4）需要有启动子才能发挥作用，对启动子没有严格的专一性