HPLC分析方法的建立与开发.pptx
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1、建立分析方法建立分析方法色谱分离度与分离性能色谱分离度与分离性能HPLC分离的机理分离的机理色谱工作者关心的基本问题色谱工作者关心的基本问题-色谱峰之间的分离度色谱峰之间的分离度totRAmAUtimetRBR=R=分离度分离度t tRA RA=组分组分A A的保留时间的保留时间t tRBRB=组分组分B B的保留时间的保留时间w=w=峰的基线宽度峰的基线宽度w w1/21/2=半峰宽半峰宽分离度值分离度值等梯度洗脱的基本分离度公式等梯度洗脱的基本分离度公式N:总的理论塔板数总的理论塔板数;柱效柱效k:k:容量因子容量因子 (保留因子保留因子),),色谱峰的保留作用色谱峰的保留作用:色谱峰的相
2、对分离程度色谱峰的相对分离程度;选择性作用选择性作用影响分离度的因素影响分离度的因素容量因子对分离度的影响容量因子对分离度的影响容量因子容量因子 -流动相组成的影响流动相组成的影响选择性选择性影响选择性的参数影响选择性的参数降低增加 较弱的溶剂较强的溶剂异丙醇/水甲醇/水乙腈/水C-2C-18容易超载不容易超载改变流动相组成改变流动相组成改变固定相改变固定相有机成分含量低的固定相有机成分含量低的固定相 有机成分含量高的固定相有机成分含量高的固定相色谱柱温度对分离度的影响色谱柱温度对分离度的影响柱效柱效计算柱效计算柱效典型的流速值典型的流速值4.61-23.00.4-0.82.10.2-0.41
3、.00.05-0.09柱内径柱内径 mm(5um 粒度粒度)mL/minflow rate2=i.d.2i.d.12flow rate1柱外体积的影响柱外体积的影响10 L20 LTime,min.2.1 x 150 mmF=0.2 mL/min.样品体积样品体积连接管路的体积连接管路的体积检测器体积检测器体积 检测器电子线路的时间常数检测器电子线路的时间常数所需分离度与柱长匹配所需分离度与柱长匹配峰对称性峰对称性提高分离度提高分离度增大 k增加选择性提高柱效分离度与分离度与 k,n 和和 的关系的关系液相色谱流动相及固定相液相色谱流动相及固定相流动相流动相 与与GCGC流流动动相相不不同同,
4、HPLCHPLC流流动动相相为为溶溶剂剂,它它既既有有运运载载作作用用,又又和和固固定定相相一一起起参参予予对对组组分分的的竞竞争争,因因此溶剂的选择对分离十分重要。此溶剂的选择对分离十分重要。1 1、理想的溶剂应有下列特性理想的溶剂应有下列特性 1 1)化学稳定性好,)化学稳定性好,与固定相不互溶、不发生反应与固定相不互溶、不发生反应2 2)必须和检测器相适应必须和检测器相适应 使用使用UVUV检测器时,溶剂截止波长要小于测量波长检测器时,溶剂截止波长要小于测量波长 使使用用折折光光率率检检测测器器,溶溶剂剂的的折折光光率率要要与与待待测测物物的的折折光率有较大差别光率有较大差别3 3)对待
5、测物具一定极性和选择性)对待测物具一定极性和选择性4 4)高高纯纯度度。否否则则基基线线不不稳稳或或产产生生杂杂峰峰,同同时时可可使使截截止波长增加;止波长增加;尽量避免使用有显著毒性的溶剂尽量避免使用有显著毒性的溶剂5 5)适宜的粘度)适宜的粘度 粘度过高,柱压增加粘度过高,柱压增加 过低(例:过低(例:戊烷、乙醚等),易产生气泡,易产生气泡2 2、溶剂的极性、溶剂的极性 溶剂的极性强弱用溶剂强度参数表示,强度参数值越大,溶剂的极性强弱用溶剂强度参数表示,强度参数值越大,表示溶剂的洗脱能力越大。表示溶剂的洗脱能力越大。序号溶剂紫外波长极限(nm)序号溶剂紫外波长极限(nm)1异辛烷1979氯
6、仿2452正己烷19010二氧六环2153甲基叔丁基醚21011丙酮3304苯27812乙醇2105二氯甲烷23313醋酸6正丙醇24014乙腈1907四氢呋喃21215甲醇2058乙酸乙酯25616水2003 3、流动相的选择、流动相的选择4 4、梯度洗脱、梯度洗脱 特点:可以缩短总的特点:可以缩短总的色谱周期,提高分离效色谱周期,提高分离效能,改善峰形,减少拖能,改善峰形,减少拖尾,可以增加灵敏度,尾,可以增加灵敏度,会引起基线漂移会引起基线漂移固定相固定相化学键合固定相化学键合固定相方方法法:通通过过化化学学反反应应将将有有机机分分子子键键合合在在载载体体表表面面形形成成柱填柱填(约有约
7、有3/43/4以上分离问题是在化学键合固定相上进行以上分离问题是在化学键合固定相上进行)特点:特点:稳定、流失小、适于梯度淋洗稳定、流失小、适于梯度淋洗分分离离机机理理:兼兼有有吸吸附附、分分配配两两种种分分离离模模式式。化化学学键键合合的的表表面面覆覆盖盖度度决决定定哪哪种种机机理理起起主主要要作作用用。对对多多数数键键合相来说,以分配机理为主。合相来说,以分配机理为主。载体载体主要是硅胶(表面有硅醇基)主要是硅胶(表面有硅醇基),特点为:特点为:可以制备成粒度分布窄的多种粒度可以制备成粒度分布窄的多种粒度 机械强度好,可以填充成稳定、高效的填充床机械强度好,可以填充成稳定、高效的填充床 长
8、期高压操作下不变形长期高压操作下不变形 反压较低、柱寿命长反压较低、柱寿命长 较其它材料制成的柱有更高的柱效较其它材料制成的柱有更高的柱效 适用于小分子、大分子的分析和制备适用于小分子、大分子的分析和制备 高高pHpH值下会分解(值下会分解(pHpH8 8)键合方法:键合方法:(l l)硅酯化()硅酯化(Si-O-RSi-O-R)键合固定相键合固定相 (2)2)硅氮型(硅氮型(=Si-N=Si-N=)共价键合固定相共价键合固定相 (3 3)硅烷化)硅烷化(Si-O-Si-RSi-O-Si-R)键合固定相键合固定相使用键合固定相应注意的问题使用键合固定相应注意的问题 硅胶键合相的稳定性硅胶键合相
9、的稳定性 键合相色谱分离的重现性键合相色谱分离的重现性 键合相色谱分离的选择性键合相色谱分离的选择性 键合相色谱柱的再生键合相色谱柱的再生 化学键合相色谱法化学键合相色谱法正相色谱和反相色谱正相色谱和反相色谱反相色谱的定义:反相色谱的定义:在非极性的固定相上,用极性较大在非极性的固定相上,用极性较大的液体作流动相进行物质分离分析的方法。即:反的液体作流动相进行物质分离分析的方法。即:反相色谱中键合固定相的极性要小于流动相的极性相色谱中键合固定相的极性要小于流动相的极性正相色谱的定义:正相色谱的定义:在极性的固定相上,用极性较小的在极性的固定相上,用极性较小的液体作流动相进行物质分离分析的方法。
10、即:正相液体作流动相进行物质分离分析的方法。即:正相色谱中键合固定相的极性要大于流动相的极性色谱中键合固定相的极性要大于流动相的极性正相色谱和反相色谱正相色谱和反相色谱的差别:正相色谱和反相色谱的差别:正相色谱正相色谱反相色谱反相色谱固定相极性固定相极性大大小小流动相极性流动相极性小至中等小至中等中至大中至大组分流出顺序组分流出顺序极性小的组分先流极性小的组分先流出出极性大的组分先流极性大的组分先流出出流动相极性增大流动相极性增大保留时间变小保留时间变小保留时间变大保留时间变大分离组分分离组分油溶性或水溶性的油溶性或水溶性的极性和强极性化合极性和强极性化合物物非极性、极性或离非极性、极性或离子
11、型化合物子型化合物正相色谱正相色谱低极性流动相低极性流动相反相色谱反相色谱高极性流动相高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间时间时间时间时间待测物极性:待测物极性:ABC正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系正相键合相色谱法正相键合相色谱法 固定相:固定相:正相色谱中采用正相色谱中采用极性极性键合固定相,是键合固定相,是把全多孔(或薄壳)微粒硅胶载体,经酸活把全多孔(或薄壳)微粒硅胶载体,经酸活化处理制成表面含有大量化处理制成表面含有大量硅羟基硅羟基的载体后,的载体后,再和含有胺基、腈基、醚基的硅烷化试剂反再和含有胺基
12、、腈基、醚基的硅烷化试剂反应,生成表面具有应,生成表面具有胺基、腈基、醚基胺基、腈基、醚基的极性的极性固定相。固定相。流动相流动相:在在非非极极性性或或极极性性小小的的溶溶剂剂(如如烃烃类类)中中加加入入适适量量的的极极性性溶溶剂剂(如如氯氯仿仿、醇醇、乙乙腈腈等等),分分离离极极性性化化合合物物。此此时时,组组分分的的分分配配比比k k值值随随其其极极性性的的增加而增大,但随流动相极性的增加而降低。增加而增大,但随流动相极性的增加而降低。主主要要用用于于分分离离异异构构体体、极极性性不不同同的的化化合合物物,特特别适用于分离别适用于分离不同类型的化合物不同类型的化合物。反相键合相色谱法反相键
13、合相色谱法 采用采用非极性键非极性键合固定相合固定相,是把全多孔是把全多孔(或薄壳或薄壳)微粒硅胶载体微粒硅胶载体,经酸活化处理后经酸活化处理后,和含有和含有烷基链烷基链或苯基或苯基的硅烷化试剂反应的硅烷化试剂反应,生成表面具有烷基生成表面具有烷基(或苯基或苯基)的非极性固定相,如的非极性固定相,如C18C18、C8C8流动相:流动相:流动相是采用极性较强的溶剂,如甲醇、乙腈、流动相是采用极性较强的溶剂,如甲醇、乙腈、水和无机盐的缓冲溶液等。它多用于分离多环芳烃水和无机盐的缓冲溶液等。它多用于分离多环芳烃等低极性化合物等低极性化合物v若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流动相,若采用含一定比
14、例的甲醇或乙腈的水溶液作流动相,可用于分离极性化合物可用于分离极性化合物v若采用水和无机盐的缓冲液为流动相,则可分离一若采用水和无机盐的缓冲液为流动相,则可分离一些易离解的样品,如有机酸、有机碱、酚类等些易离解的样品,如有机酸、有机碱、酚类等 具有柱效高,能获得无拖尾色谱峰的优点具有柱效高,能获得无拖尾色谱峰的优点硅胶硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响时间,时间,min固定相:固定相:C1固定相:固定相:C8固定相:固定相:C181-尿嘧啶;尿嘧啶;2-苯酚;苯酚;3-乙酰苯;乙酰苯;4-硝基苯;硝基苯;5-苯甲酸甲酯;苯甲酸甲酯;6-甲苯甲
15、苯可见:反相键合色谱中,键合相碳链越长,分离效果越好。可见:反相键合色谱中,键合相碳链越长,分离效果越好。分析方法建立分析方法建立分析时要了解的情况分析时要了解的情况v想办法得到各种信息想办法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品,或有否类似样品向同行了解是否做过此类样品,或有否类似样品的分析方法的分析方法查文献和方法,如查文献和方法,如CA,AA,AOAC,EPA-CA,AA,AOAC,EPA-仪器制造商的文献仪器制造商的文献v充分了解自己的样品充分了解自己的样品v对色谱柱有足够的了解对色谱柱有足够的了解掌握分离机理,自己开发方法掌握分离机理,自己开发方法分析时要了解的情况(续分析时要了解的
16、情况(续1)v灵敏度的要求有多高灵敏度的要求有多高?v样品的本底是否很复杂样品的本底是否很复杂?v有多少组份要分析有多少组份要分析?v对分析的精确度、准确度等有多高要求对分析的精确度、准确度等有多高要求?v是否因是日常检验,而要求方法容易使用是否因是日常检验,而要求方法容易使用?分离分离(制备制备)时要了解的情况时要了解的情况v要分离(即制备)的样品量有多大要分离(即制备)的样品量有多大?v要分离的组份在样品中的含量很高要分离的组份在样品中的含量很高?还是微量还是微量?v是否需要保持生物活性是否需要保持生物活性?v对分离产物纯度的要求有多高对分离产物纯度的要求有多高?v纯度或活性的鉴定如何完成
17、纯度或活性的鉴定如何完成?什么化合物参数能用于分离什么化合物参数能用于分离?分子量不同分子量不同/MW 2000 MW 2000 凝胶渗透凝胶渗透 /凝胶过滤凝胶过滤离子化分子离子化分子 离子对离子对/离子交换离子交换 极性不同极性不同 吸附吸附/反相色谱反相色谱 同系物同系物 /苯系物苯系物 反相反相 中性、酸和碱的混合物中性、酸和碱的混合物反相反相 生物分子生物分子 亲和亲和/HIC/HIC/凝胶过滤凝胶过滤/反相反相 立体异构体立体异构体 吸附吸附 手性化合物手性化合物 手性色谱手性色谱结构数据结构数据数据收集数据收集固定相和流固定相和流动相选择动相选择一般的具体步骤一般的具体步骤v先用
18、一根短的色谱柱先用一根短的色谱柱v用相对较高的流速用相对较高的流速v使用尽可能纯度高的标准品使用尽可能纯度高的标准品v先用高强度的洗脱液先用高强度的洗脱液v调节调节k k 值改变保留值值改变保留值v调节调节 值改变选择性值改变选择性v调节柱长度改变柱效及分离速度调节柱长度改变柱效及分离速度记住记住 每次改变一个参数每次改变一个参数使用文献方法注意点使用文献方法注意点v色谱柱填料的种类、品牌是否相同色谱柱填料的种类、品牌是否相同?v注意文献方法的流动相注意文献方法的流动相是否损害色谱柱是否损害色谱柱?如色谱填料品牌不同,需要调整流动相如色谱填料品牌不同,需要调整流动相v注意色谱柱的规格:内径、柱
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