application-of-confocal.pptx
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1、二、共聚焦激光扫描显微镜应用领域二、共聚焦激光扫描显微镜应用领域只要目的结构是用荧光探针标记的,都可用共聚焦激光扫描荧只要目的结构是用荧光探针标记的,都可用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。光显微镜观察。形态学研究:形态学研究:细胞凋亡、肿瘤细胞分类细胞凋亡、肿瘤细胞分类 分子生物学:分子生物学:原位杂交,原位杂交,DNA、RNA定量,定量,DNA损伤修复、损伤修复、外外源性基因在真核细胞的表达、定位源性基因在真核细胞的表达、定位,荧光能量共振转移荧光能量共振转移大分子构大分子构象的改变、受体与配体相互作用象的改变、受体与配体相互作用 活细胞动态荧光测量:活细胞动态荧光测量:细胞内细胞内Ca+、K
2、+、H+等离子的动态分布及等离子的动态分布及动态定量、动态定量、荧光漂白恢复荧光漂白恢复细胞连接间的信息沟通细胞连接间的信息沟通 直接对活组织或整体胚胎观察:直接对活组织或整体胚胎观察:单光子共聚焦激光扫描系统的局单光子共聚焦激光扫描系统的局限性:荧光漂白限性:荧光漂白l l(一一一一)在细胞原位检测核酸在细胞原位检测核酸在细胞原位检测核酸在细胞原位检测核酸l l(二二二二)原位检测蛋白质原位检测蛋白质原位检测蛋白质原位检测蛋白质,抗体及其他分抗体及其他分抗体及其他分抗体及其他分子子子子l l(三三三三)检测细胞凋亡检测细胞凋亡检测细胞凋亡检测细胞凋亡l l(四四四四)细胞器观察及测定细胞器观
3、察及测定细胞器观察及测定细胞器观察及测定l l(五五五五)检测细胞融合检测细胞融合检测细胞融合检测细胞融合l l(六六六六)观察细胞骨架观察细胞骨架观察细胞骨架观察细胞骨架l l(七七七七)检测细胞间缝隙连接通讯检测细胞间缝隙连接通讯检测细胞间缝隙连接通讯检测细胞间缝隙连接通讯l l(八八八八)检测细胞内脂肪检测细胞内脂肪检测细胞内脂肪检测细胞内脂肪形态学观测形态学观测(一一)在细胞原位检测核酸在细胞原位检测核酸l l检测核酸的荧光探针检测核酸的荧光探针检测核酸的荧光探针检测核酸的荧光探针l l1 1 碘化丙啶碘化丙啶碘化丙啶碘化丙啶(PI)-(PI)-不能进入完整的细胞膜不能进入完整的细胞膜
4、不能进入完整的细胞膜不能进入完整的细胞膜l l其最大吸收光谱为其最大吸收光谱为其最大吸收光谱为其最大吸收光谱为536nm536nm,最大发射光谱为,最大发射光谱为,最大发射光谱为,最大发射光谱为617nm617nm l l2 Hoechst33342,Hoechst33258 2 Hoechst33342,Hoechst33258 和和和和DAPIDAPIl l最大吸收光谱为最大吸收光谱为最大吸收光谱为最大吸收光谱为345nm345nm(紫外光激发),最大发射光谱为(紫外光激发),最大发射光谱为(紫外光激发),最大发射光谱为(紫外光激发),最大发射光谱为460nm460nm,发射明亮的蓝色荧光
5、发射明亮的蓝色荧光发射明亮的蓝色荧光发射明亮的蓝色荧光 l l3 AO(3 AO(吖啶橙吖啶橙吖啶橙吖啶橙)l l标记标记标记标记DNADNA时主要通过嵌入式结合(时主要通过嵌入式结合(时主要通过嵌入式结合(时主要通过嵌入式结合(AOAO分子插入双链分子插入双链分子插入双链分子插入双链DNADNA碱基对之碱基对之碱基对之碱基对之间),其最大吸收光谱为间),其最大吸收光谱为间),其最大吸收光谱为间),其最大吸收光谱为502nm502nm,最大发射光谱为,最大发射光谱为,最大发射光谱为,最大发射光谱为530nm530nm,呈绿色,呈绿色,呈绿色,呈绿色荧光;标记荧光;标记荧光;标记荧光;标记RNA
6、RNA时通过静电吸引结合方式,其最大吸收光谱为时通过静电吸引结合方式,其最大吸收光谱为时通过静电吸引结合方式,其最大吸收光谱为时通过静电吸引结合方式,其最大吸收光谱为460nm460nm,最大发射光谱为,最大发射光谱为,最大发射光谱为,最大发射光谱为650nm650nm,呈红色荧光,呈红色荧光,呈红色荧光,呈红色荧光 PI标记的细胞核(红色),绿色显示标记的细胞核(红色),绿色显示FITC标记的微管标记的微管 Hoechst 33342标记的细胞核标记的细胞核(蓝色)(蓝色)640480-染色染色方法:AO描述:细胞多角形,贴壁良好,铺展面积大(二二)原位检测蛋白质原位检测蛋白质,抗体及其他分
7、子抗体及其他分子l l常用的荧光探针常用的荧光探针常用的荧光探针常用的荧光探针:l l荧光染料荧光染料荧光染料荧光染料FITC:FITC:蓝光激发蓝光激发蓝光激发蓝光激发,发出发出发出发出明亮绿色明亮绿色明亮绿色明亮绿色荧光荧光荧光荧光l lFITCFITC的最大吸收光谱为的最大吸收光谱为的最大吸收光谱为的最大吸收光谱为490495nm490495nm,最大发射光谱为,最大发射光谱为,最大发射光谱为,最大发射光谱为520530nm520530nm l l罗丹明罗丹明罗丹明罗丹明Rhodamine:Rhodamine:比比比比FITCFITC光稳定性好光稳定性好光稳定性好光稳定性好,在在在在生理
8、条件下对生理条件下对生理条件下对生理条件下对PHPH变化不敏感变化不敏感变化不敏感变化不敏感,荧光强度受细荧光强度受细荧光强度受细荧光强度受细胞自发荧光的干扰较小胞自发荧光的干扰较小胞自发荧光的干扰较小胞自发荧光的干扰较小l l最大吸收光谱为最大吸收光谱为最大吸收光谱为最大吸收光谱为550nm550nm,最大发射光谱,最大发射光谱,最大发射光谱,最大发射光谱620nm620nm呈呈呈呈橙红色橙红色橙红色橙红色荧光荧光荧光荧光 l l荧光双标,荧光多标荧光双标,荧光多标荧光双标,荧光多标荧光双标,荧光多标蓝色示细胞核(蓝色示细胞核(DAPI),绿色示微管(绿色示微管(FITC),),红色示微丝(
9、红色示微丝(TRITC)Confocal image showing a macrophage in the lung of a mouse infected with SARS-corona virus.Double immunofluorescence labels the macrophage in red with antibodies against Mac-2 and viral protein in green with antibodies against spike 3 绿色荧光蛋白(绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein GFP)蓝色荧光蓝色荧光 GF
10、P 绿色荧光绿色荧光 Ca2+肠腔素肠腔素Aequoren+n*可对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察可对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察Confocal microscope image of GFP-tagged Merlin(green),in the larval salivary gland.The Merlin protein is cytoplasmic but closely associated with the plasma membrane in the apical end of epithelial cells.The polytene chromosome
11、s in the nuclei are stained with propidium iodide(red).(三三)检测细胞凋亡检测细胞凋亡l l通常用的方法通常用的方法:l l1 细胞核形态观察细胞核形态观察l l2 脱氧核苷酸未端转移酶介导的缺口脱氧核苷酸未端转移酶介导的缺口末端标记法末端标记法(TUNEL)l l3 Annexin-V试剂盒是检测凋亡细胞试剂盒是检测凋亡细胞膜损伤的新方法膜损伤的新方法凋亡形态学变化凋亡形态学变化-凋亡小体凋亡小体1细胞核形态观察I期细胞核成波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态Iia期细胞核的染色质高度聚集,边缘化
12、Iib期细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。(三三)检测细胞凋亡检测细胞凋亡l l2 2 脱氧核苷酸未端转移酶介导的缺口末端标记法脱氧核苷酸未端转移酶介导的缺口末端标记法脱氧核苷酸未端转移酶介导的缺口末端标记法脱氧核苷酸未端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)(TUNEL)TUNEL is a common method for detecting DNA fragmentation that results from apoptotic signaling cascades.The assay relies on the presence of nicks in the DNA which
13、can be identified by terminal deoxynucleotidyl transferase,an enzyme that will catalyze the addition of dUTPs that are secondarily labeled with a marker.It may also label cells that have suffered severe DNA damagel l3 Annexin-V3 Annexin-V试剂盒是检测凋亡细胞膜损伤的新方法试剂盒是检测凋亡细胞膜损伤的新方法试剂盒是检测凋亡细胞膜损伤的新方法试剂盒是检测凋亡细胞膜
14、损伤的新方法 在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为3536kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素(FITC、FITC)标记,以标记了的Annexin V作为荧光探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。Light and confocal micrographs showing cel
15、lular and nuclear morphology in human preimplantation embryos.Nuclei are labeled DAPI(blue).(A)Fragmenting day 2 human embryo,with fragments arrowed.(B)Nuclei from a day 6 blastocyst showing TUNEL-labeled(pink)fragmented nuclei Annexin-V-FITC与与PI显示细胞凋亡显示细胞凋亡(四四)细胞器观察及测定细胞器观察及测定1线粒体线粒体 Mitochondria R
16、odamin 123 Mitotracker Green FM Mitotracker Orange CMTMRos Mitotracker Orange 2 溶酶体溶酶体 Lysosome 中性红中性红 AO LysoTracker Green DND-26/Blue/Red3 内质网内质网 Endoplasmic Reticulum DiOC64 高尔基体高尔基体 Golgi apparatus NBD C6-ceramie细胞内线粒体线粒体LysoTracke标记溶酶体溶酶体,绿色示微管,核DAPI复染ER-Tracker Blue-White DPX标记细胞内质网标记细胞内质网高尔基复
17、合体染色Golgiapparatus(green),microtubules(red),andDNA(blue).(五五)观察细胞骨架观察细胞骨架l l骨架骨架(微丝微丝,微管和中等纤维微管和中等纤维)直标直标:一抗一抗+荧光探针荧光探针(如如:肌动蛋白肌动蛋白actin Rhodamine-phalloidin)间标间标:二抗二抗+荧光探针荧光探针(如如:微管蛋白微管蛋白tublin)细胞骨架染色,肌动蛋白Rhodamine-phalloidin)细胞骨架染色,微丝微丝细胞骨架染色微管微管(六六)检测细胞间缝隙连接通讯检测细胞间缝隙连接通讯l l染料荧光染料荧光染料荧光染料荧光黄黄黄黄(LY
18、)-(LY)-黄色带电荷的小分子强荧光物黄色带电荷的小分子强荧光物黄色带电荷的小分子强荧光物黄色带电荷的小分子强荧光物质质质质,不通过细胞膜不通过细胞膜不通过细胞膜不通过细胞膜,但可以很容易通过细胞间隙连但可以很容易通过细胞间隙连但可以很容易通过细胞间隙连但可以很容易通过细胞间隙连接通讯(接通讯(接通讯(接通讯(GJICGJIC),从标记的细胞从标记的细胞从标记的细胞从标记的细胞(划痕法划痕法划痕法划痕法)传输到传输到传输到传输到邻近细胞邻近细胞邻近细胞邻近细胞.l l观察观察观察观察LYLY向邻近细胞的传输速率向邻近细胞的传输速率向邻近细胞的传输速率向邻近细胞的传输速率,用以表示用以表示用以
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