RNA干扰技术基本原理与应用1.pptx
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1、什么是什么是RNA干扰干扰RNA干扰干扰(RNA interference,RNAi),又称又称转录后基因沉默转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS),是指将特异性,是指将特异性同源双链同源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内,使导入到细胞内,使目的基因的不表达或表达水平下降目的基因的不表达或表达水平下降.2001、2002年连续被年连续被Science评为年度十大成就评为年度十大成就!目前应用的基因干扰技术目前应用的基因干扰技术DNA水平的基因干扰技术水平的基因干扰技术基因敲除技术基因敲除技术寡核苷酸与双链寡核苷酸与双链DNA 杂交杂
2、交采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因子子目前应用的基因干扰技术目前应用的基因干扰技术mRNA水平的基因干扰技术水平的基因干扰技术用反义用反义RNA 技术阻遏翻译过程技术阻遏翻译过程,破坏内源破坏内源性性mRNA设计寡核苷酸来破坏与设计寡核苷酸来破坏与mRNA 结合的蛋白结合的蛋白质质,使使mRNA 不稳定不稳定双链双链RNA 干扰技术(干扰技术(RNAi)RNAi的发现和发展历程的发现和发展历程1984 年年,Jonathan 研究小鼠研究小鼠L 细胞时发现细胞时发现反义反义mRNA 会干扰同源基因的表达,机制会干扰同源基因的表达,机制不清不清1990年年
3、 Jorgensen等等 矮牵牛颜色加深实矮牵牛颜色加深实验验“共抑制共抑制(co-suppresion)”RNAi的发现和发展历程的发现和发展历程19951995年年年年 Su Guo Su Guo 和和和和Ken Emphues Ken Emphues 反义反义反义反义RNARNA阻断秀丽小杆线虫阻断秀丽小杆线虫阻断秀丽小杆线虫阻断秀丽小杆线虫par-1par-1基因的表达基因的表达基因的表达基因的表达 实实实实验验验验 首次发现首次发现首次发现首次发现 RNARNA干扰现象干扰现象干扰现象干扰现象19981998年年年年 Andrew FireAndrew Fire和和和和Craig M
4、ello Craig Mello 发现单链发现单链发现单链发现单链RNARNA抑制作用较弱,而纯化的抑制作用较弱,而纯化的抑制作用较弱,而纯化的抑制作用较弱,而纯化的dsRNAdsRNA可高效、特异地抑制基因的表达可高效、特异地抑制基因的表达可高效、特异地抑制基因的表达可高效、特异地抑制基因的表达 Nature1998Nature1998;391:806-11391:806-11 正式提出正式提出正式提出正式提出RNARNA干扰的概念干扰的概念干扰的概念干扰的概念RNAi的发现和发展历程的发现和发展历程1999年年 Tuschl等等 报道在哺乳动物中也存在报道在哺乳动物中也存在RNAi2001
5、 年年 Berstein 等等 提出只有提出只有22 核苷酸核苷酸dsRNA才有特异性的才有特异性的阻断效应,并发现体内分解阻断效应,并发现体内分解dsRNA 为为siRNAs(short/small interfering RNA)的的DICER 酶酶RNAi的发现和发展历程的发现和发展历程2002 年年 Novina 等等 用用RNAi 技术实现了对技术实现了对HIV-1 病毒的阻抑病毒的阻抑2004年年 Morris 等等 用用RNAi技术实现了对人细胞基因的抑制技术实现了对人细胞基因的抑制 Science 2004(August 27);305:1289-1292RNAi的主要特点和优
6、势的主要特点和优势诱导转录后水平的基因沉默诱导转录后水平的基因沉默具有高度的特异性具有高度的特异性抑制基因表达的高效性可在不同细胞之间抑制基因表达的高效性可在不同细胞之间传递甚至传到子代中去传递甚至传到子代中去 “基因沉默系统化基因沉默系统化”siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶共同点共同点 特异性特异性 靶向性靶向性siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶不同点不同点独特的双链结构独特的双链结构需要需要Dicer、RdRp、解旋酶、激酶等协同、解旋酶、激酶等协同因子因子siRNA 本身无催化活性本身无催化活性在细胞内可能具有
7、相对的稳定性在细胞内可能具有相对的稳定性具有一定的可遗传性具有一定的可遗传性RNAi的主要过程的主要过程启动阶段启动阶段 dsRNA(500nt左右最佳左右最佳)被被Dicer 酶特异酶特异性识别,以一种性识别,以一种ATP依赖的方式逐步切割成依赖的方式逐步切割成siRNA长度:长度:21-25nt结构:结构:3端悬垂两个未配对的碱基端悬垂两个未配对的碱基UU细胞中内源性细胞中内源性dsRNA的形成的形成基因组中基因组中DNA 反向重复序列的转录产物反向重复序列的转录产物同时转录反义和正义同时转录反义和正义RNA 病毒病毒RNA 复制中间体复制中间体以单链以单链RNA 为模板由细胞或病毒的为模
8、板由细胞或病毒的RNA 依依赖赖RNA 聚合酶聚合酶(RdRp)催化合成催化合成dsRNADicer酶酶RNAase III超家族成员。结构中包括一个螺超家族成员。结构中包括一个螺旋酶结构域,两个旋酶结构域,两个RNA酶酶结构域,一个结构域,一个双链双链RNA结合位点结合位点对单链对单链RNA没有活性没有活性对对200500nt的的dsRNA作用效果最好,能作用效果最好,能降解成降解成25nt左右的左右的siRNA广泛存在广泛存在RdRp(RNA dependent RNA polymerase)使异常的使异常的RNA转变为转变为dsRNA参与细胞内参与细胞内dsRNA和和siRNA的扩增的扩
9、增siRNA与靶与靶mRNA 的结合可激活的结合可激活RdRp,形成大量的形成大量的dsRNARNAi的主要过程的主要过程效应阶段效应阶段RNA诱导沉默复合体(诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)的形成的形成RISC的激活:的激活:ATP依赖的解双链过程依赖的解双链过程在在siRNA反义链的指导下反义链的指导下(靶序列的识别),靶序列的识别),RISC特异性切特异性切 割、降解靶割、降解靶mRNA,导致基,导致基因表达失活因表达失活 RNAi技术的实验方法技术的实验方法siRNA的设计原则的设计原则序列大小序列大小 19-21nt,最好以,最好
10、以A或或G开始开始从从mRNA的的AUG开始,寻找开始,寻找AA二连序列,二连序列,作为潜在的作为潜在的RNAi靶位点靶位点不要针对不要针对5和和3端非编码区(端非编码区(untranslated regions,UTRs)RNAi技术的实验方法技术的实验方法siRNA的设计原则的设计原则设计设计24个序列个序列,BLAST 比对基因序列以确比对基因序列以确保序列设计的特异性保序列设计的特异性优先选择优先选择 GC 含量含量30-50%的序列的序列设计适当的阴性对照序列设计适当的阴性对照序列阴性对照序列的设计阴性对照序列的设计特异性特异性siRNA中的碱基进行随机排列,且中的碱基进行随机排列,
11、且行行BLAST基因比对基因比对 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG ATTCGTGCTCAATGCAATCG在特异性在特异性siRNA引入引入12个错配碱基个错配碱基 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAGTTTAAATCCTAG目标序列筛选的相关网站目标序列筛选的相关网站http:/www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.htmlhttp:/www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.htmlhttp:/sfold.wadsworth.org/sirna.plhttp:/sfold.wadsworth.org/s
12、irna.plhttp:/ 查找已经证实的查找已经证实的siRNA的网站的网站http:/ lhttp:/web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADhttp:/web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.htmlB.htmlhttp:/ d siRNA的制备方法的制备方法体外制备方法体外制备方法化学合成化学合成siRNA体外转录获取体外转录获取siRNA利用利用Dicer或或 RNase消化长的消化长的dsRNA成成siRNA化学合成法制备化学合成法制备siRNA优点:优点:纯度高纯度高 合成量不受限合成量不受限 能被标记能被标记缺点:价格昂贵、合成周
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