全内反射荧光显微镜介绍.pptx
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1、全内反射荧光显微镜发展历史优势应用分型及结构基本原理基本原理发展与展望发展与展望细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发荧
2、光,荧光显微镜就是对这类物质进行定性亦可发荧光,荧光显微镜就是对这类物质进行定性亦可发荧光,荧光显微镜就是对这类物质进行定性亦可发荧光,荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。和定量研究的工具之一。和定量研究的工具之一。和定量研究的工具之一。发展历史荧光显微镜的概念荧光显微镜的概念 在细胞生物学方面,传统光学显微镜始终不能解决生物样本显在细胞生物学方面,传统光学显微镜始终不能解决生物样本显微中的几个重要问题:微中的几个重要问题:1.1.显微图像的显微图像的信噪比信噪比不高;不高;2.2.光源对生物样本照射的损伤;光源对生物样本照射的损伤;3.3.光学衍射所致的光学衍射所致的分辨极
3、限分辨极限(R 0.61/nsinR 0.61/nsin):):传统的光学显微镜由于受到传统的光学显微镜由于受到光瞳远场衍射效应光瞳远场衍射效应的影响的影响,存在分辨极限存在分辨极限,瑞利将之归纳为瑞利将之归纳为R 0.61/nsin(u/2)R 0.61/nsin(u/2),其中其中R为分辨力为分辨力,为成像光波波长为成像光波波长,nsin(u/2),nsin(u/2)为物透镜的为物透镜的数值孔径数值孔径,即即NA NA 值,值,u为孔为孔径角径角,因此光学显微镜空间分辨极限因此光学显微镜空间分辨极限250 nm250 nm。发展历史全内反射荧光显微术的发展历程全内反射荧光显微术的发展历程近
4、年来人们开发出了一系列光学显微镜。近年来人们开发出了一系列光学显微镜。近年来人们开发出了一系列光学显微镜。近年来人们开发出了一系列光学显微镜。其中,其中,其中,其中,全内反射荧光显微术全内反射荧光显微术全内反射荧光显微术全内反射荧光显微术(Total internal(Total internal(Total internal(Total internal reflection fluorescence microscopy,reflection fluorescence microscopy,reflection fluorescence microscopy,reflection fluo
5、rescence microscopy,TIRFMTIRFMTIRFMTIRFM)是是是是近年来新兴的一种光学成像技术。近年来新兴的一种光学成像技术。近年来新兴的一种光学成像技术。近年来新兴的一种光学成像技术。全内反射荧光显微术的发展历程全内反射荧光显微术的发展历程Hirsch fieldHirsch field完成了完成了第一个第一个全内反射全内反射荧光实验荧光实验19651965年年AxelrodAxelrod等生物物理等生物物理学家对学家对TRIFMTRIFM技术技术及基本原理进行描及基本原理进行描述,并探索了其生述,并探索了其生物应用。物应用。20世世纪纪80808080年代早期年代早
6、期年代早期年代早期20世世纪纪9090年代年代新型物镜透镜、聚光新型物镜透镜、聚光镜和超灵敏探测器的镜和超灵敏探测器的出现,使出现,使TRIFMTRIFM技术技术得到充分发展。得到充分发展。19951995年年YanagidaYanagida小小组用组用TIRFMTIRFM技技术首次在液体术首次在液体溶液中得到了溶液中得到了荧光标记的单荧光标记的单个蛋白质分子个蛋白质分子的成像。的成像。该项技术已经应用到该项技术已经应用到许多单分子的研究中许多单分子的研究中这是首次尝试用全内反射荧光这是首次尝试用全内反射荧光这是首次尝试用全内反射荧光这是首次尝试用全内反射荧光法测液体中的单个分子的荧光。法测液
7、体中的单个分子的荧光。法测液体中的单个分子的荧光。法测液体中的单个分子的荧光。将全反射理论与生物细胞的荧将全反射理论与生物细胞的荧将全反射理论与生物细胞的荧将全反射理论与生物细胞的荧光成像技术相结合是一种全新光成像技术相结合是一种全新光成像技术相结合是一种全新光成像技术相结合是一种全新的突破。的突破。的突破。的突破。肌球蛋白酶活性测量,肌收缩力的产生,肌球蛋白酶活性测量,肌收缩力的产生,肌球蛋白酶活性测量,肌收缩力的产生,肌球蛋白酶活性测量,肌收缩力的产生,荧光标记驱动蛋白动态研究。荧光标记驱动蛋白动态研究。荧光标记驱动蛋白动态研究。荧光标记驱动蛋白动态研究。19961996年年Moerner
8、Moerner小组小组又用这项技术又用这项技术实现了限制在实现了限制在丙烯酰胺胶体丙烯酰胺胶体的纳米孔中的的纳米孔中的单分子的三维单分子的三维成像。成像。至今至今基本原理基本原理全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜的基本设计思路的基本设计思路全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜的基本原理的基本原理全内反射荧光显微术是利用全内反射产生的消逝波全内反射荧光显微术是利用全内反射产生的消逝波激发样品激发样品,从而使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光团受从而使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光团受到激发到激发,荧光成像的信噪比大大提高。可以看到样品表面,荧光成像的信噪比大大提高。可以看到样品表面,单分子的活
9、动情况。这种方法的成像装置简单,极易和其单分子的活动情况。这种方法的成像装置简单,极易和其它成像技术、探测技术相结合,目前已成功的实现它成像技术、探测技术相结合,目前已成功的实现100nm100nm甚至更低的空间分辨率。甚至更低的空间分辨率。基本原理基本原理全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜的基本设计思路的基本设计思路全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜的基本原理的基本原理荧光激发原理荧光激发原理荧荧光光捕捕捉捉原原理理snellsnell定律定律:n1sin1=n2sin2当n1大于n2时,全反射就可能发生:2=90c=sin-1(n2/n1)即所有的入射光线全部反射出来,称为全内反射荧光
10、激发原理荧光激发原理沿着入射面上的介质边界传播在平行界面方向以平行波场方式传播在垂直界面方向则是呈指数衰减。隐失波的强度-深度图荧光激发原理荧光激发原理非均匀波透射强度和浸透深度公式透射强度和浸透深度公式透射强度和浸透深度公式透射强度和浸透深度公式T12(i)-分界面处的透射强度分界面处的透射强度d 12 -渗透深度渗透深度i -入射角入射角 -入射光波长入射光波长对于可见光波长380780nm而言,浸透深度为100nm。荧光激发原理荧光激发原理箭头箭头表示激光的方向,激光被全反射,同时产生在z方向成指数衰减的隐失波。黄色小圆点黄色小圆点表示被隐失波激发的荧光分子,白色小圆点白色小圆点表示未被
11、激发的荧光分子。荧荧光光捕捕捉捉原原理理CCD相机CCD相机的高灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度特点使全内反射荧光显微镜利用消逝波照射样品并使其成像成为可能,也成就了其高信噪比。CCD相机的快速成像快速成像快速成像快速成像特点提高了其时间分辨率,使得观察单分子的运动、细胞物质的分泌、蛋白质的相互作用成为可能并成为这方面的优势观察仪器。目前使用CCD 探测,可达到的量子产率已到80%,成像速率200 Hz.当对活细胞成像时,为了达到单分子级的灵敏度或是为了减少曝光时间,需要采用图像增强器。荧荧光光捕捕捉捉原原理理全内反射显微镜的分型及其结构全内反射荧光显微镜根据其成像系统的不同可分为棱镜型和物镜型
12、两种类型两种类型的全内反射荧光显微镜成像系统,1)为棱镜型,2)为物镜型。(一)棱镜型全内反射荧光显微镜利用激光经过棱镜并产生全内反射,其消逝波照射已被荧光标记的生物样品,其激发光从另一侧进入物镜并被CCD相机捕捉。棱镜型全内反射荧光显微镜光路示意图棱镜型全内反射荧光显微镜光路示意图评价棱镜型系统在实现上更加容易,它只需要激光光源、棱镜和显微镜。在探测上,它也不容易受到入射光信号的干扰。放置样品的空间受到棱镜的限制。(二)物镜型全内反射显微镜 收集样品荧光信号的接收器 显微镜的物镜 发生全内反射的光学器件。由于细胞的典型折射率为1.331.38,因此要想实现全内反射,物镜的NA 必须大于1.3
13、8。表达式为:NA=nsin(u/2)nsin(u/2)nsincNA 为物镜的数值孔径,n,u分别为物镜的折射率(浸没油)和孔径角。c 为发生全反射的临界角。二者比较棱镜型全内反射荧光显微镜物镜型全内反射荧光显微镜05级医学实验级医学实验宋一萌宋一萌90513111全内反射荧光显微技术利用全内反射产生全内反射荧光显微技术利用全内反射产生的消逝波激发样品,由于消逝波强度成指的消逝波激发样品,由于消逝波强度成指数衰减,使激发区域限定在样品表面的一数衰减,使激发区域限定在样品表面的一薄层范围内,因此具有其它光学成像技术薄层范围内,因此具有其它光学成像技术无法比拟的高信噪比。无法比拟的高信噪比。当今
14、世界上研究单分子科学最具前途的新当今世界上研究单分子科学最具前途的新型生物光学显微技术之一型生物光学显微技术之一可用来实现对单个荧光分子的直接探测。可用来实现对单个荧光分子的直接探测。全内反射荧光显微镜里用消逝波作为样品的激发光源,并用有着高灵敏度和高时间分辨率的CCD相机(成像速率200Hz)捕捉样品荧光,因此具有如下优点:1:信噪比高(相对共聚焦显微镜):信噪比高(相对共聚焦显微镜)2:分辨率高(相对其他的光学显微镜):分辨率高(相对其他的光学显微镜)3:对生物样本损伤小(相对电镜)可:对生物样本损伤小(相对电镜)可以进行活体物质的研究和单分子的动以进行活体物质的研究和单分子的动态研究。态
15、研究。全内反射荧光显微术正是凭借其独特的优全内反射荧光显微术正是凭借其独特的优势势(它的荧光激发深度只在它的荧光激发深度只在100 nm 的薄的薄层范围内层范围内),从而成为研究从而成为研究细胞表面科学细胞表面科学如生如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术。的光学成像技术。全内反射荧光显微成像法不再采用扫描成全内反射荧光显微成像法不再采用扫描成像像,大大提高了成像速度大大提高了成像速度,可以满足实时成像可以满足实时成像的要求的要求;另一方面它的图像解释相对于近场另一方面它的图像解释相对于近场,干涉显微成像来说也较简单。干涉显微成像来说也较简单
16、。现在全内反射荧光显微术已被广泛用于现在全内反射荧光显微术已被广泛用于实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移(FRET)FRET)ATP ATP 酶的翻转酶的翻转酶的翻转酶的翻转 聚合物内单个分子的结构变化聚合物内单个分子的结构变化聚合物内单个分子的结构变化聚合物内单个分子的结构变化生物质膜附近的神经分泌腺的颗粒运动生物质膜附近的神经分泌腺的颗粒运动生物质膜附近的
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