共焦显微镜剖析.pptx
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1、激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术样品要求样品要求原理原理 功能功能 在生物医学中的应用在生物医学中的应用激光扫描共焦显微镜技术及应用激光扫描共焦显微镜技术及应用The techniques and application of Confocal Laser Scanning Microscopy激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术人眼分辨率:人眼分辨率:0.2mm光学显微镜分辨率:光学显微镜分辨率:0.2525m电子显微镜分辨率:电子显微镜分辨率:0.2nm共焦显微镜分辨率:共焦显微镜分辨率:0.18 m 二、二、原理原理激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术原理小结
2、原理小结:Confocal 利利用用放放置置在在光光源源后后的的照照明明针针孔孔和和放放置置在在检检测测器器前前的的探探测测针针孔孔实实现现点点照照明明和和点点探探测测,来来自自光光源源的的光光通通过过照照明明针针孔孔发发射射出出的的光光聚聚焦焦在在样样品品焦焦平平面面的的某某个个点点上上,该该点点所所发发射射的的荧荧光光成成像像在在探探测测针针孔孔上上,该该点点以以外外的的任任何何发发射射光光均均被被探探测测针针孔孔阻阻挡挡。照照明明针针孔孔与与探探测测针针孔孔对对被被照照射射点点或或被被探探测测点点来来说说是是共共轭轭的的,因因此此被被探探测测点点即即共共焦焦点点,被被探探测测点点所所在在
3、的的平平面面即即共共焦焦平平面面。计计算算机机以以像像点点的的方方式式将将被被探探测测点点显显示示在在计计算算机机屏屏幕幕上上,为为了了产产生生一一幅幅完完整整的的图图像像,由由光光路路中中的的扫扫描描系系统统在在样样品品焦焦平平面面上上扫扫描描,从从而而产产生生一一幅幅完完整整的的共共焦焦图图像像。只只要要载载物物台台沿沿着着Z轴轴上上下下移移动动,将将样样品品新新的的一一个个层层面面移移动动到到共共焦焦平平面面上上,样样品品的的新新层层面面又又成成像像在在显显示示器器上上,随随着着Z轴轴的的不不断断移移动动,就可得到样品不同层面连续的光切图像就可得到样品不同层面连续的光切图像。激光扫描共焦
4、显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的共焦显微镜与传统显微镜的区别区别1.抑制图像的模糊,获得清晰的图像抑制图像的模糊,获得清晰的图像激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的共焦显微镜与传统显微镜的区别区别2.具有更高的轴向分辨率,并可获取连续光学切片具有更高的轴向分辨率,并可获取连续光学切片conventionalconfocal激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的共焦显微镜与传统显微
5、镜的区别区别3.增加侧向分辨率增加侧向分辨率激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的共焦显微镜与传统显微镜的区别区别4.由于点对点扫描去除了杂散光的影响由于点对点扫描去除了杂散光的影响激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术三三.激光扫描共焦显微镜的设计特点激光扫描共焦显微镜的设计特点:1.点照明点照明2.具有照明具有照明pinhole和探测和探测pinhole3.照明照明pinhole和探测和探测pinhole共轭共轭(共焦共焦),共焦点即共焦点即被探测点,被探测点所在的平面为共焦平面被探测点,被探测点所在的平面为共焦平面4.具有扫描系统具有扫描系统 逐点扫描
6、成像逐点扫描成像 5.具有多个(四个)具有多个(四个)荧光通道,可同时探测多个荧光通道,可同时探测多个被标记物被标记物 激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术技术指标(技术指标(Leica TCS SP2):1.xy分辨率比传统显微镜小分辨率比传统显微镜小1.4x 传统显微镜传统显微镜:Rxy=0.61/NA(0.25 m)Confocal:Rxy=0.4/NA(0.18 m)2.样品的最大厚度样品的最大厚度:取决于取决于:物镜的物镜的NA、物镜的、物镜的工作距离工作距离 激光的穿透力、样品的透明度激光的穿透力、样品的透明度 Z轴的最大移动范围轴的最大移动范围(166 m、Z-wide)
7、3.样品的最小光切厚度样品的最小光切厚度:(载物台最小移动距离为载物台最小移动距离为40nm)取决于取决于:物镜的物镜的NA、针孔大小、针孔大小 Z轴的最小移动步距轴的最小移动步距:40nm Z轴的分辨率轴的分辨率:0.35 m 激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术4.激光器激光器 Ar激光器激光器:458nm,476nm,488nm,514nm GreNe:543nm;HeNe:633nm Ar激光器激光器(UV):361nm 激光器的特点激光器的特点:1)方向性好方向性好:激光基本延直线传播激光基本延直线传播 2)单色性好单色性好:=10-8nm 3)高亮度高亮度:激光方向性好激光
8、方向性好,其在空间上的能量分布是高度其在空间上的能量分布是高度 集中的。集中的。4)偏振性偏振性:激光为平面偏振光激光为平面偏振光,光纤耦合光纤耦合激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术5.四个荧光通道四个荧光通道,一个透射光通道一个透射光通道 即除了可同时采集多标记荧光图像外即除了可同时采集多标记荧光图像外还可以同时采集透射光图像还可以同时采集透射光图像,但透射光但透射光图像为图像为非共焦图像非共焦图像。激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术6.扫描速度扫描速度:slow 220lines/s 512 512 2-3秒秒 slow2 440lines/s(2:双向扫描):双向扫描
9、)medium 450lines/s 512 512 1.7秒秒 medium2 900lines/s fast 1000lines/s 512 512 0.7秒秒 128 128 0.2秒秒 fast2 2000lines/s7.扫描密度扫描密度:64 64 128 128 512 512 1024 1024 2048 2048 激光扫描共焦显微镜激光扫描共焦显微镜技术的应用技术的应用The application of Confocal Laser Scanning Microscopy激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用 功能功能.1.多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集多
10、荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集2.无损伤、连续光学切片,显微无损伤、连续光学切片,显微“CT”3.真正的三维重组真正的三维重组4.假三维图的显示假三维图的显示5.可沿可沿Z轴(轴(xy平面)和平面)和Y轴(轴(xz平面)方向进行光切平面)方向进行光切6.定量分析定量分析7.时间序列扫描时间序列扫描:xyt、xyzt 和和 xt 扫描扫描8.图像处理图像处理9.旋转扫描旋转扫描10.感兴趣区域扫描感兴趣区域扫描11.光谱扫描光谱扫描 激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用应用应用定位、定量定位、定量三维重组三维重组动态测量动态测量 活细胞或组织内游离活细胞或组织内游离Ca2+分布
11、和浓度的变化分布和浓度的变化 测量测量(Mg2+、Zn+、Na+、K+)自由基的检测自由基的检测 药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 蛋白质的转位蛋白质的转位激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用活细胞内活细胞内H+浓度(浓度(pH值值)的测量)的测量线粒体线粒体膜电位膜电位的测量的测量荧光漂白恢复(荧光漂白恢复(FRAP)的测量)的测量笼锁解笼锁的测量笼锁解笼锁的测量荧光能量共振转移(荧光能量共振转移(FRET)的测量)的测量其他应用其他应用激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用一、定位、定量一、定位、定量免疫荧光标记(单标、双标或三免疫
12、荧光标记(单标、双标或三 标)的定位、标)的定位、定量:如:细胞膜受体或抗原的分布,定量:如:细胞膜受体或抗原的分布,微丝、微管的分布、微丝、微管的分布、两种或三种蛋两种或三种蛋 白的白的共存共存与与共定位共定位、蛋白与细胞器的、蛋白与细胞器的 共定位、核转录因子转位和干细胞的共定位、核转录因子转位和干细胞的 增值、分化增值、分化细胞凋亡细胞凋亡:AnnexinV-fitc+PI 末端原位杂交末端原位杂交-fitc+PI荧光原位杂交:荧光原位杂交:染色体基因定位染色体基因定位 激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用定位、定量研究中常用荧光探针定位、定量研究中常用荧光探针1.Amine-R
13、eactive Probes 与与抗抗体体耦耦联联、与与配配体体耦耦联联、与与肽肽耦耦联联、与与人人工工合合成成的的寡寡聚聚核核苷苷酸酸耦联的探针,可用于免疫组化、荧光原位杂交、受体标记等耦联的探针,可用于免疫组化、荧光原位杂交、受体标记等 Green Red Fura-red FITC 494/518 TRITC 544/572 Cy5 650/690 (异硫氰基荧光素异硫氰基荧光素)(四甲基异硫氰基罗丹明四甲基异硫氰基罗丹明)Alexa Fluor 488 488/530 PE 565/578 (藻红蛋白藻红蛋白)Texas Red 595/615 (德州红德州红)Cy3 558/568B
14、ODIPY FL 503/512 BODIPY TMR 543/569 BODIPY TR 592/618 激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用1)细胞表面抗原、胞内某种蛋白细胞表面抗原、胞内某种蛋白 免役荧光标记:免役荧光标记:与抗体耦联与抗体耦联,直标直标:一抗一抗+荧光探针荧光探针 间标间标:二抗二抗+荧光探针荧光探针 如如:微管蛋白微管蛋白tublin(抗抗 tublin抗体抗体+荧光探针荧光探针)肌动蛋白肌动蛋白actin(Palloidine+荧光探针荧光探针)2)细胞膜表面受体细胞膜表面受体配体配体+荧光探针荧光探针 如如:nAchR、mAchR、多巴胺受体、多巴胺受体(
15、D1,D2)标记标记 Gm1:霍乱毒素受体霍乱毒素受体 霍乱毒素霍乱毒素+FITC 激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用2.标记标记细胞器细胞器荧光探针荧光探针1)线粒体线粒体 Mitochondria Rodamin 123 505/534,可染活细胞,阳离子,可染活细胞,阳离子,可检可检 测线粒体膜电位测线粒体膜电位,且在多数细胞中停留且在多数细胞中停留 时间短时间短 JC1 线粒体膜电位低时为单体线粒体膜电位低时为单体 490/527 发绿光发绿光 线粒体膜电位高时为多聚体线粒体膜电位高时为多聚体 490/590 发红光发红光 可标记活细胞线粒体,且为检测线粒体膜电位最可标记活细
16、胞线粒体,且为检测线粒体膜电位最 佳探针佳探针Mitotracker Green FM 490/516,染活细胞或固定细胞染活细胞或固定细胞,稳定不漏出稳定不漏出Mitotracker Orange CMTMRos 551/576,(氧化型氧化型)Mitotracker Orange 还原型还原型,只能染活细胞只能染活细胞 激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用2)溶酶体溶酶体 Lysosome 中性红中性红 541/640:微偏碱性微偏碱性,可标记溶酶体等酸性器官可标记溶酶体等酸性器官 为非特异性为非特异性 AO:LysoTracker Green DND-26 504/511,染活细
17、胞染活细胞 LysoTracker Blue LysoTracker Red3)内质网内质网 Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500:非特异性非特异性,较较高高浓度标记浓度标记内质网内质网,较较低低浓度标记浓度标记线粒体线粒体4)高尔基体高尔基体 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536,可染活或死细胞可染活或死细胞 激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用 细胞器的单克隆抗体细胞器的单克隆抗体5)细胞核细胞核 PI propidium iodide 536/617 DNA/RNA 死细胞死细胞碘化丙啶碘化丙啶EB eth
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- 显微镜 剖析
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