凝胶电泳.pptx
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1、一、凝胶电泳一、凝胶电泳它是一种分析鉴定重组它是一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段,同时质与核酸相互作用的重要实验手段,同时也是分子生物学研究方法的技术基础。也是分子生物学研究方法的技术基础。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳脉冲电场凝胶电泳脉冲电场凝胶电泳1、基本原理、基本原理带有负电荷的带有负电荷的DNA或或RNA核苷酸链,依靠无反核苷酸链,依靠无反应活性的稳定的介质(琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺应活性的稳定的介质(琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶)和缓冲液,凝胶)和缓冲液,在电场中以一定的迁移率从负在电场中以一定的迁移率从负极移向正
2、极极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异,以及所带电荷的不同,可以通过电泳状的差异,以及所带电荷的不同,可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。将其混合物中的不同成分彼此分开。DNA的迁移速率决定因素的迁移速率决定因素1DNA分子的大小分子的大小双链双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比;反比;2琼脂糖浓度琼脂糖浓度浓度越低,相同核酸分子迁移越快;浓度越低,相同核酸分子迁移越快;3DNA的构象的构象一般同一分子:超螺旋环状线状切口环状。一般同一分子:超螺旋环状线状切口环状。4凝胶和电泳缓
3、冲液中的溴化乙锭凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭溴化乙锭(溴化乙锭(EB)插入双链)插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和造成其负电荷减少、刚性和长度增加。长度增加。5所用的电压所用的电压低电压时低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。片段迁移率与所用的电压成正比。6琼脂糖种类琼脂糖种类常见的有两种:标准琼脂糖和低熔点琼脂糖;常见的有两种:标准琼脂糖和低熔点琼脂糖;凝胶电泳的分辨力:凝胶电泳的分辨力:与凝胶的类型和密度相关与凝胶的类型和密度相关琼脂糖凝胶的分辨力在琼脂糖凝胶的分辨力在0.250Kb之间之间;聚丙烯酰胺的分辨力在聚丙烯酰胺的分辨力在11000bp之间之间Separation Ra
4、nge Vs.%AgaroseLowGelingAgarose4-60.02-0.4 不同类型琼脂糖的性质不同类型琼脂糖的性质琼脂糖类型琼脂糖类型凝结温度凝结温度/熔化温度熔化温度/标准琼脂糖标准琼脂糖35389095不同厂家不同厂家生产的不生产的不同商品其同商品其凝结温度凝结温度和熔化温和熔化温度有一定度有一定差异差异40428590高强度琼脂糖高强度琼脂糖34438595修饰的低熔点修饰的低熔点/凝点琼脂糖凝点琼脂糖253563653565超低熔点超低熔点8154045低黏性低熔点琼低黏性低熔点琼脂糖脂糖25307038853075AgaroseGelElectrophoresis琼脂糖(
5、琼脂糖(agarose)是一种从红色海藻中提)是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。取出的线性多糖聚合物。半乳糖及其衍生物构成的中性物质,不带电荷半乳糖及其衍生物构成的中性物质,不带电荷2、琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型凝胶。凝胶。凝胶。凝胶。D-D-半乳糖
6、半乳糖3 3,6-6-脱水脱水-L-L-半乳糖半乳糖 琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点(一)优点(一)优点(一)优点(一)优点1.1.因不含硫酸根和羧基,几乎消除了琼脂的电渗因不含硫酸根和羧基,几乎消除了琼脂的电渗因不含硫酸根和羧基,几乎消除了琼脂的电渗因不含硫酸根和羧基,几乎消除了琼脂的电渗2.2.对蛋白质吸附极微,故无拖尾现象。对蛋白质吸附极微,故无拖尾现象。对蛋白质吸附极微,故无拖尾现象。对蛋白质吸附极微,故无拖尾现象。3.3.凝凝凝凝胶胶胶胶结结结结构构构构均均均均匀匀匀匀,孔孔孔孔径径径径较较较较大大大大,可可可可用用用用来来来来分分分分离离离离酶酶酶酶的的的的复复复复合合合合物、核
7、酸、病毒等大分子物质。物、核酸、病毒等大分子物质。物、核酸、病毒等大分子物质。物、核酸、病毒等大分子物质。4.4.透明度较好,可直接或干燥成薄膜后进行染色。透明度较好,可直接或干燥成薄膜后进行染色。透明度较好,可直接或干燥成薄膜后进行染色。透明度较好,可直接或干燥成薄膜后进行染色。5.5.不不不不吸吸吸吸收收收收紫紫紫紫外外外外光光光光,可可可可直直直直接接接接利利利利用用用用紫紫紫紫外外外外光光光光吸吸吸吸收收收收法法法法作作作作定定定定量量量量测定测定测定测定6.6.有热可逆性有热可逆性有热可逆性有热可逆性(二)缺点(二)缺点(二)缺点(二)缺点1.1.机械强度差,易破碎,浓度不能太低。机
8、械强度差,易破碎,浓度不能太低。机械强度差,易破碎,浓度不能太低。机械强度差,易破碎,浓度不能太低。2.2.易被细菌污染,不易保存,临用前配制。易被细菌污染,不易保存,临用前配制。易被细菌污染,不易保存,临用前配制。易被细菌污染,不易保存,临用前配制。3.3.琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖支支支支持持持持层层层层上上上上的的的的区区区区带带带带易易易易于于于于扩扩扩扩散散散散,电电电电泳泳泳泳后后后后必必必必须须须须立立立立即固定染色。即固定染色。即固定染色。即固定染色。4.4.与与与与PAGEPAGE相比,分子筛作用小,区带少。相比,分子筛作用小,区带少。相比,分子筛作用小,区带少。相比,分子筛作
9、用小,区带少。分为常熔点的琼脂糖和低熔点(分为常熔点的琼脂糖和低熔点(LMP)琼脂糖。)琼脂糖。(1)LMP琼脂糖琼脂糖熔点:熔点:6265熔解后,在熔解后,在37可保持液态数小时;在可保持液态数小时;在25可可保持液态约保持液态约10min回收回收DNA操作:将凝胶在操作:将凝胶在65下加热数分钟,再下加热数分钟,再向液态琼脂糖中加入过量酚液抽提向液态琼脂糖中加入过量酚液抽提DNA,经离心,经离心获得含获得含DNA分子的上清液,酶切分子的上清液,酶切DNA片段后电泳。片段后电泳。(2)琼脂糖凝胶电泳的参数:)琼脂糖凝胶电泳的参数:缓冲液:缓冲液:1TAE(TBETPE)凝胶的含量:根据检测的
10、凝胶的含量:根据检测的DNA大小大小加加DNA样品:样品:1g,指示剂,指示剂溴酚蓝电泳条件:大片断低电压长时间,小片段高电压电泳条件:大片断低电压长时间,小片段高电压短时间短时间(5V/cm)(2)琼脂糖凝胶电泳的参数:)琼脂糖凝胶电泳的参数:染色和观察:溴化乙锭(染色和观察:溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)染色,在)染色,在300nm波长的紫外下观察(凝胶成波长的紫外下观察(凝胶成像仪),像仪),能看到能看到0.05g的微量的微量DNADNA的片断大小与荧光强度成正比的片断大小与荧光强度成正比操作预染色的标本预染色的标本预染色的标本预染色的标本 用已知分子量的标准DNA对D
11、NA片断大小的估算 Sample Well 25 ng 1 kb ladder0.8%Agarose124681012kbAgarose Gel ElectrophoresisEtBr Detection Limit:5-10 ng DNAAgarose gel electrophoresisAgarose gel electrophoresis【注意事项】1.琼脂糖融化时,档位不宜太高。琼脂糖融化时,档位不宜太高。2.制胶和加样过程中要防止气泡的产生。制胶和加样过程中要防止气泡的产生。3.EB具有强诱变性,可致癌。必须戴手套操作,严格具有强诱变性,可致癌。必须戴手套操作,严格注意防护。注意防
12、护。4.加样时,加样时,Tip头不宜插入样品孔太深,也不要穿破胶头不宜插入样品孔太深,也不要穿破胶孔壁,否则样品渗漏或孔壁,否则样品渗漏或DNA带型不整齐。带型不整齐。5.电源接通时,应核实凝胶的方向是否正确。电源接通时,应核实凝胶的方向是否正确。6.电泳仪有电压显示,并不一定标志电泳槽已接通,电泳仪有电压显示,并不一定标志电泳槽已接通,应观察电极气泡出现情况。负极的气泡比正极多一倍,应观察电极气泡出现情况。负极的气泡比正极多一倍,表示电泳已开始。表示电泳已开始。7.溴化乙锭可插入到溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中,在紫外光的分子的双链中,在紫外光的照射下,插入溴化乙锭的照射下,插入溴化乙锭
13、的DNA呈橙红色荧光,所以溴呈橙红色荧光,所以溴化乙锭可以作为荧光指示剂指示化乙锭可以作为荧光指示剂指示DNA含量和位置。含量和位置。3、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳PolyacrylamideGelElectrophoresis,PAGE-原理原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide,简,简称称Acr)和交联剂和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide,简称,简称Bis)在加速剂在加速剂N,N,N,N 四甲基乙二胺四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetramethylethylene
14、diamine,简称,简称TEMED)和催和催化剂过硫酸铵化剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8,简称简称AP)或核黄素或核黄素(ribofavin即即vitaminB2,C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶,以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶胶,以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,简称,简称PAGE)。丙烯酰胺丙烯酰胺N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺原理聚丙烯酰胺凝胶三维结构聚丙烯酰胺凝胶三维结构聚丙烯酰胺凝胶电泳种
15、类聚丙烯酰胺凝胶电泳种类 1变性聚丙烯酰胺凝胶变性聚丙烯酰胺凝胶用于单链用于单链DNA片段的分离或纯化。片段的分离或纯化。变性的变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。基组成及序列完全无关。用途:放射性用途:放射性DNA探针的分离、探针的分离、DNA测序反应等。测序反应等。2非变性聚丙烯酰胺凝胶非变性聚丙烯酰胺凝胶用于双链用于双链DNA片段的分离和纯化。片段的分离和纯化。注:迁移率受其碱基组成和序列的影响。注:迁移率受其碱基组成和序列的影响。用途:制备高纯度的用途:制备高纯度的DNA片段。片段。(三)(三)DNADNA在聚丙烯胺凝胶中的有效
16、分离范围在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围丙烯酰胺浓度丙烯酰胺浓度(%)有效分离范围有效分离范围(bp)二甲苯氰二甲苯氰FF溴酚蓝溴酚蓝3.5100020004601005.080500260658.0604001604512.040200702015.025150601520.061004512注注:N,N-:N,N-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/301/30;Home图图.1 .1 夹心垂直板电泳槽示意图夹心垂直板电泳槽示意图 1.1.导线接头导线接头 2.2.下贮槽下贮槽 3.3.凹形橡胶框凹形橡胶框 4.4.样品槽模板样品槽模板 5.5.固定螺丝固定螺
17、丝 6.6.上贮槽上贮槽7.7.冷凝系统冷凝系统图图.2 .2 凝胶模示意图凝胶模示意图1.1.样品槽模板样品槽模板 2.2.长玻璃板长玻璃板3.3.短玻璃板短玻璃板 4.4.凹形橡胶框凹形橡胶框 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的原理)的原理:蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时,它的迁移率取决于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时,它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠钠(sodiumdodecylsulfate
18、,简称简称SDS),则蛋白质分子,则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量,而与所带电荷的电泳迁移率主要取决于它的分子量,而与所带电荷和形状无关。因此可和形状无关。因此可以利用以利用SDS-PAGE测定蛋白质分测定蛋白质分子量子量。3、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳Polyacrylamide Gel Electrophoresis,PAGE缓冲液:缓冲液:TBE凝胶聚丙烯酰胺电泳:凝胶聚丙烯酰胺电泳:丙稀酰胺丙稀酰胺/亚甲双丙稀酰胺(亚甲双丙稀酰胺(29:1););TEMED(四甲基乙二胺,加速剂)(四甲基乙二胺,加速剂)过硫酸铵(过硫酸铵(10,催化剂,催化剂)。)。垂直板垂直
19、板电泳装置电泳装置加样加样样品迁样品迁移方向移方向电泳过程中分子迁移的规律,小分子走在前头,大分电泳过程中分子迁移的规律,小分子走在前头,大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品混合样品带孔胶带孔胶按分子按分子大小分离大小分离电泳方向电泳方向电泳电泳小分子小分子大分子大分子夹在两块玻璃夹在两块玻璃板之间的凝胶板之间的凝胶电泳电泳缓冲液缓冲液电泳电泳缓冲液缓冲液加在槽中的经加在槽中的经SDS处理的样品处理的样品分子量小分子量小分子量大分子量大电源电源电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色
20、后的凝胶照片水平式电泳装置水平式电泳装置电泳缓冲液电泳缓冲液凝胶凝胶 PAGE PAGE 的的 特特 点点1.1.具有分子筛效应,分辨率高具有分子筛效应,分辨率高2.2.样品不易扩散,用量少,灵敏度可达样品不易扩散,用量少,灵敏度可达1010-6-6g g3.3.化学性质稳定,分子结构中富含酰胺基具化学性质稳定,分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团有稳定的亲水基团4.4.凝胶不带电荷,消除了电渗现象凝胶不带电荷,消除了电渗现象5.5.机械强度好,有弹性,在一定浓度范围内机械强度好,有弹性,在一定浓度范围内无色透明无色透明6.6.网孔可调节网孔可调节 4、脉冲电场凝胶电泳(、脉冲电场凝胶电泳(
21、PFGE)1984年,年,D.R.Cantor发明的。发明的。分离超大分子量的分离超大分子量的DNA分子分子。在脉冲电泳中,电场方向是周期变化的,头一个在脉冲电泳中,电场方向是周期变化的,头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成脉冲电场方向与核酸的移动方向成45度角,下一度角,下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45度角。度角。B+A-+A-B脉冲电场电泳示意图脉冲电场电泳示意图脉冲场凝胶电泳原理图脉冲场凝胶电泳原理图 北北 南南 脉冲场电泳脉冲场电泳常规电泳常规电泳两组电极,排列不均匀两组电极,排列不均匀;一组电极,电场方向不变,电极排列均匀,一组
22、电极,电场方向不变,电极排列均匀,定时改变电场方向,定时改变电场方向,DNA分子的净分子的净DNA移动方向与电场方向相同。整个电泳移动方向与电场方向相同。整个电泳移动方向与两电场呈移动方向与两电场呈45o,在电泳过,在电泳过过程保持电压稳定。常规方法制备过程保持电压稳定。常规方法制备DNA程中,电压有时可随时间的增加而样程中,电压有时可随时间的增加而样品增加,品增加,制备制备DNA样品与常规方法样品与常规方法不同不同4、脉冲电场凝胶电泳(、脉冲电场凝胶电泳(PFGE)由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着,这就使得小
23、、以及作用时间都在交替地变换着,这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向,来适应凝分子必须随时调整其泳动的方向,来适应凝胶孔隙的无规则变化。胶孔隙的无规则变化。与分子量小的与分子量小的DNA分子相比,分子量大的分子相比,分子量大的DNA分分子需要较多的次数来更换其构型和方位,使之能子需要较多的次数来更换其构型和方位,使之能够按新的方向游动,所以迁移率就慢,从而达到够按新的方向游动,所以迁移率就慢,从而达到了分离大分子量了分离大分子量DNA分子的目的。分子的目的。PFGE can resolve large DNA fragments类型类型垂直脉冲场电泳系统垂直脉冲场电泳系统(vertica
24、lpulsedfield)场翻转系统场翻转系统(fieldinversion)旋转胶系统旋转胶系统(rotatinggel)箝位匀强电场系统箝位匀强电场系统(contour-clampedhomogeneouselectricfield)动态调控闭合均一电场动态调控闭合均一电场电泳电泳A-+AB-+B垂直交变电场系统垂直交变电场系统场翻转系统场翻转系统箝位匀强电场系统箝位匀强电场系统旋转胶系统旋转胶系统A-+AB-+BA-+AB-+B-+影响分辨率的因素影响分辨率的因素1 1 脉冲时间脉冲时间(0.1s-1000s)0.1s-1000s):增加脉冲时间分离较增加脉冲时间分离较大分子,减少脉冲时
25、间分离较小分子。大分子,减少脉冲时间分离较小分子。2 2 电压:电压:若固定脉冲时间,增加电场强度就增大了若固定脉冲时间,增加电场强度就增大了可分离最大片段的范围,但是太大的电场强度会导可分离最大片段的范围,但是太大的电场强度会导致较小片段泳动的紊乱。致较小片段泳动的紊乱。3电场夹角:电场夹角:电场方向的夹角常为电场方向的夹角常为1100-1200,研究证实研究证实900夹角也非常有效的。夹角也非常有效的。4温度:温度:标准琼脂糖电泳基本在室温进行,标准琼脂糖电泳基本在室温进行,PFGE一般应在一般应在4进行。较高的温度进行。较高的温度DNA泳动较快;但是较高的温度也引起较小片泳动较快;但是较
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