分子生物学研究方法和技术.pptx

分子生物学研究方法和技术湖南省农业生物技术研究中心詹庆才电话：84691351Email:本人基本情况1984年获湖南农学院农学学士学位。1987年获中国科学院遗传研究所理学硕士学位，专业:分子遗传。1999年11月-200年11月受国家科技部派遣，在日本农林水产省北海道国家农业研究中心博士后特别研究员；主要从事基因定位和功能基因的筛选。年：主要从事水稻细胞质雄性不育机理研究；水稻分子育种技术研究。4：主要从事杂交水稻种子纯度快速鉴定技术研究；水稻品种指纹研究；基因定位和分子育种技术研究。课次课次课堂讲授课堂讲授第一次第一次绪绪 论论植物总植物总RNARNA提取提取第二次第二次植物总植物总DNADNA提取提取第三次第三次核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳第四次第四次聚合酶链式反应聚合酶链式反应第五次第五次微卫星分子标记快速鉴定杂交种子纯度技术微卫星分子标记快速鉴定杂交种子纯度技术第六次第六次Southern blotSouthern blot、Northern blot Northern blot、WesternWesternblotblot第七次第七次植物蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳和双向电泳植物蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳和双向电泳第八次第八次基因定位方法基因定位方法第九次第九次植物基因转化植物基因转化第十次第十次c c和基因组文库的构建和基因组文库的构建第十一次第十一次载体系统载体系统1、分子生物学的发展历程1871年，首次发现DNA（鲑精DNA）。1943年，证明DNA为遗传分子，而不是蛋白（1944，OTAvery）1953年，DNA双螺旋模型提出（JDWatson（美）和FHCCrick（英），1962年或诺贝尔生理学、医学奖）。从而为分子生物学这一学科奠基。1961年，合成mRNA，破译第一个遗传密码（MWNirenberg（美），1968年获诺贝尔生理学、医学奖）基础研究的创新，与推动人类文明的进步。（以上被称为理论上的三大发现）1970年，分离出第一个限制性内切酶（WArber（瑞士），1978年获诺贝尔医学奖）1970年，Baltimore和Temin发现了逆转录酶长期的基础研究积累迎来了突飞猛进的高潮。1973年，Cohen把质粒作为基因工程的载体使用基础研究向应用研究的拓展。（以上被称为生物工程技术的的三大发明）3个事例：（1）1976年，重组DNA成功（HBoyer和SNColen，1981年获诺贝尔化学奖）勇敢的科学精神。（2）1982年，美国一制药公司在2000升发酵液中提取出100克精制胰岛素。相当于从1600磅动物胰腺中的提取量效率、成本、质量、竞争。（3）荷兰最早把分子生物学产品“猪牛痢疾疫苗”投放市场，比以上美国的胰岛素早半年后来居上。人类对生命现象的认识人类对生命现象的认识20世纪世纪个体个体 染色体染色体 基因基因 DNA SNP生物与非生物间的界限消失了！生物与非生物间的界限消失了！21世纪世纪 基因克隆，拼结基因克隆，拼结 组装植物、动物、婴儿！组装植物、动物、婴儿！数、数、理、化相关学科理、化相关学科生物学实验技术生物学实验技术渗透渗透 交叉交叉近代生物学近代生物学生物学生物学个性个性共性共性宏观生物学宏观生物学（生态学为核心）（生态学为核心）微观生物学微观生物学（分子生物学为核心）（分子生物学为核心）细胞水平细胞水平分子水平分子水平结构生物学，发育生物学，结构生物学，发育生物学，神经生物学等新兴学科发展神经生物学等新兴学科发展生物多样性生物多样性研究研究资源保护与资源保护与利用利用人类生态环境的保护人类生态环境的保护工农业生产持续发展工农业生产持续发展现代生物学的发展现代生物学的发展分子生物学分子生物学分子结构生物学分子结构生物学分子发育生物学分子发育生物学分子神经生物学分子神经生物学分子育种学分子育种学分子肿瘤学分子肿瘤学分子细胞生物学分子细胞生物学分子免疫学分子免疫学分子病毒学分子病毒学分子生理学分子生理学分子考古学分子考古学分子遗传学分子遗传学分子数量遗传学分子数量遗传学分子生态学分子生态学分子进化学分子进化学.分子生物学分子生物学渗透到生物学几乎所有学科渗透到生物学几乎所有学科分子生物学分子生物学成为现代生命科学的共同语言成为现代生命科学的共同语言 分子生物学的延伸分子生物学的延伸2 分分 子子 生物生物 学学 的的 概概 念念2.1 分子生物学的定义分子生物学的定义2.2 分子生物学的三大原则分子生物学的三大原则2.3 分子生物学研究的三大主要领域分子生物学研究的三大主要领域2.4 分子生物学发展的三大支撑学科分子生物学发展的三大支撑学科2.1 分子生物学的定义分子生物学的定义Molecular biology is the study of genes and their activities at the molecular level,including transcription,translation,DNA replication,recombination and translocation.分子生物学分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭示生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。分子生物学与生物化学之间的关系与区别分子生物学与生物化学之间的关系与区别分子生物学分子生物学分子生物学分子生物学研究研究生物大分子的结构、功能及生物大分子的结构、功能及生物大分子的结构、功能及生物大分子的结构、功能及信息传递信息传递信息传递信息传递过程，从分子水平研究生命现象。过程，从分子水平研究生命现象。生物化学生物化学生物体内的化学运动，包括化学组化学组成、变化、结构与功能，生物分子间的物质与成、变化、结构与功能，生物分子间的物质与能量转换过程能量转换过程。分子生物学分子生物学生物化学生物化学构成生物大分子的构成生物大分子的单体单体是相同的是相同的生物遗传信息的表达的生物遗传信息的表达的中心法则中心法则相同相同DNARNApolypeptidesproteincharacter高级结构高级结构生物大分子之间的互作生物大分子之间的互作个性个性2.2 分子生物学的三大原则分子生物学的三大原则共同的核酸语言共同的核酸语言 共同的蛋白质共同的蛋白质生物大分子生物大分子单体的排列单体的排列（核苷酸，氨基酸）（核苷酸，氨基酸）结结构构生生物物学学基因分子生物学基因分子生物学生物技术理论生物技术理论论与应用论与应用2.3 分子生物学研究的三大主要领域分子生物学研究的三大主要领域生物大分子的结构与功能生物大分子的结构与功能生物大分子之间的互作生物大分子之间的互作 DNAprotein DNAprotein Hormonereceptor Hormonereceptor Enzyme-substrate Enzyme-substrate基因的概念基因的概念基因的结构基因的结构基因的复制基因的复制基因的表达基因的表达基因的重组基因的重组基因的突变基因的突变基因工程基因工程细胞工程细胞工程酶工程酶工程发酵工程发酵工程蛋白质工程蛋白质工程狭义的分子生物学狭义的分子生物学分子遗传学分子遗传学2.4 分子生物学发展的三大支撑学科分子生物学发展的三大支撑学科1839-18471839-1847年年 Matthias Schleiden&Theodor Matthias Schleiden&Theodor SchwannSchwann细胞的化学组成，细胞器的结构，细胞骨架，细胞的化学组成，细胞器的结构，细胞骨架，生物大分子在细胞中的定位及功能生物大分子在细胞中的定位及功能分子生物学发展的三大支撑学科之一分子生物学发展的三大支撑学科之一 生物体由细胞组成生物体由细胞组成 所有组织的最基本单元所有组织的最基本单元-形状相似，高度分化的细胞形状相似，高度分化的细胞 细胞的发生与形成是生物界普遍和永久的规律细胞的发生与形成是生物界普遍和永久的规律CytologyMolecular Cell biology Gregor Mendel 1864 年年 GeneticsMolecular GeneticsGene structure Gene duplication Gene expression Gene recombination Gene mutation分子生物学发展的三大支撑学科之二分子生物学发展的三大支撑学科之二遗传因子假说遗传因子假说GeneticsBiochemistryNucleic Acid ChemistryProtein Chemistry(1936年年 James Sumner)分子生物学发展的分子生物学发展的 三大支撑学科之三三大支撑学科之三Enzymatic nature of crystalline Enzymatic nature of crystalline（晶体）（晶体）ProteinProteinBiochemistry3 21 21 世世 纪纪 分分 子子 生生 物物 学学 展展 望望3.1 自然科学历史舞台角色的重大变化自然科学历史舞台角色的重大变化3.2 未来生物学形成的新热点及领域未来生物学形成的新热点及领域3.3 应用生物学发展应用生物学发展3.4 21世纪世纪 生命科学的世纪生命科学的世纪3.1自然科学历史舞台自然科学历史舞台 角色将发生重大变化角色将发生重大变化引导自然科学向物质运动最高层次突破的带头学科引导自然科学向物质运动最高层次突破的带头学科 物物 理理 学学 生生 物物 学学3.2 未来生物学形成的新热点及领域未来生物学形成的新热点及领域生物大分子的高级三维结构与功能的统一生物大分子的高级三维结构与功能的统一 生物大分子之间的互作生物大分子之间的互作基因表达，基因互作基因表达，基因互作 器官发生器官发生胚胎形成胚胎形成个体发育个体发育 结构生物学（结构生物学（Structural Biology）分子发育生物学（分子发育生物学（Molecular Developing Biology）个体细胞分子整体论细胞中的定位细胞分化神经基质神经基质神经通道神经通道信息传递信息传递大分子克隆大分子克隆一级结构分析一级结构分析三维结构重建三维结构重建思维思维感情感情记忆记忆科学解释科学解释分子细胞生物学分子细胞生物学(Molecular Cell Biology)分子神经生物学（分子神经生物学（Molecular Neurobiology）计算机语言计算机语言 分辨，提取，分析，分辨，提取，分析，比较，比较，预测生物信息预测生物信息 生物大分子的结构与功能信息生物大分子的结构与功能信息 基因的识别与鉴定基因的识别与鉴定基因功能信息的提取与证实基因功能信息的提取与证实基因表达谱的绘制基因表达谱的绘制 (microarray)(microarray)蛋白质水平上基因互作的探测蛋白质水平上基因互作的探测 功能基因组学功能基因组学(Functional Genomics or postGenomics)(Functional Genomics or postGenomics)生物信息学生物信息学(Bioinformatics)(Bioinformatics)3.3 应用生物学发展应用生物学发展生物技术生物技术诊断试剂诊断试剂 治疗药物治疗药物植物品种植物品种 环境工程环境工程食品加工食品加工 生物塑料生物塑料废物处理废物处理 再生能源再生能源3.4 213.4 21世纪世纪 生命科学的世纪生命科学的世纪 二十一世纪二十一世纪 生命科学的世纪生命科学的世纪分子生物学理论的突破分子生物学理论的突破生物技术的有效应用生物技术的有效应用新旧技术的有机结合新旧技术的有机结合人口与粮食人口与粮食能源与资源能源与资源环境与生态环境与生态健康与疾病健康与疾病更加深刻更加深刻 更为明确更为明确 阐明生物大系统阐明生物大系统 生长发育生长发育 遗传变异遗传变异 繁殖死亡繁殖死亡 生生命命本本质质更加主动更加主动 更为有效更为有效 利用生物技术利用生物技术 改造生物改造生物 创造生物创造生物 新兴产业新兴产业 推动工，农，推动工，农，医医 的的 发发 展展 学习分子生物学的意义学习分子生物学的意义第一章第一章 RNARNA的分离纯化的分离纯化主要内容主要内容 前言前言一、核酸分离、纯化原则一、核酸分离、纯化原则（一）（一）保持核酸分子一级结构的完整性保持核酸分子一级结构的完整性（二）（二）防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解二、分离提取核酸的主要步骤二、分离提取核酸的主要步骤（一）（一）细胞的破碎细胞的破碎（二）（二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除核蛋白的解聚、变性蛋白的去除（三）（三）核酸的沉淀核酸的沉淀 (四）四）核酸的浓度测定核酸的浓度测定（五）（五）核酸的保存核酸的保存 核酸核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是基是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。前前 言言一、核酸分离、纯化原则一、核酸分离、纯化原则（一）保持核酸分子一级结构的完整性（一）保持核酸分子一级结构的完整性 1 1 意义意义 遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的级结级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。合的方式。2 2 分离核酸原则：分离核酸原则：1 1）温度）温度不要过高；不要过高；2 2）控制一定的控制一定的pHpH值值范围范围(pH(pH值值5-9);5-9);3 3）保持一定的保持一定的离子强度离子强度;4 4）减少物理因素对核酸降解的减少物理因素对核酸降解的机械剪切力机械剪切力.（二）防止核酸的生物降解（二）防止核酸的生物降解 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温所用器械和一些试剂需高温灭菌灭菌，提取缓冲液中需加，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂核酸酶抑制剂。1.DNA酶抑制剂酶抑制剂1 1）金属离子螯合剂：金属离子螯合剂：DNADNA酶需要金属二价离子酶需要金属二价离子MgMg2+2+、CaCa2+2+的激活，因此使用金属二价离的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制子螯合剂，可抑制DNADNA酶活性。如酶活性。如EDTA-NaEDTA-Na2 2(乙二胺四乙酸二钠乙二胺四乙酸二钠)、8-8-羟基喹啉；羟基喹啉；2 2）阴离于型表面活性剂：阴离于型表面活性剂：如如SDSSDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。沉淀。2.RNA酶（酶（RNAase)抑制剂抑制剂 RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。酸、耐碱，不宜失活。(1)皂土（皂土（bentonite）作用机制：作用机制：皂土带负电荷，能吸附皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。，使其失活。(2)DEPC(2)DEPC(二乙基焦碳酸盐二乙基焦碳酸盐)(C)(C2 2H H5 5OCOOCOOCOCOOCOOC2 2H H5 5)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。作用机制：作用机制：与蛋白质中与蛋白质中HisHis结合使蛋白变性。结合使蛋白变性。使用注意：使用注意：1 1）DEPCDEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大比使蛋白质变性的浓度大10010010001000倍。倍。2 2）容易降解，保存在）容易降解，保存在4 4 或液氮中；或液氮中；3 3）提）提RNARNA时，时，0.1%DEPC0.1%DEPC浸泡器皿浸泡器皿37 2 h37 2 h。4 4）剧毒。）剧毒。（3)3)肝素肝素（4 4）复合硅酸盐（）复合硅酸盐（Macaloid)Macaloid)（5 5）RNaseRNase阻抑蛋白（阻抑蛋白（RNasinRNasin）（6 6）氧钒核糖核苷复合物）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-(Vanadyl-Ribonucleoside Complex,VRC)Ribonucleoside Complex,VRC)二二 分离提取核酸的主要步骤分离提取核酸的主要步骤（一）细胞的破碎（一）细胞的破碎 1 1 高速组织捣碎机捣碎高速组织捣碎机捣碎 2 2 玻璃匀浆器匀浆玻璃匀浆器匀浆 3 3 超声波处理法超声波处理法 4 4 液氮研磨法液氮研磨法 5 5 化学处理法化学处理法(SDS(SDS、吐温、吐温8080等）等）6 6 生化法（溶菌酶、纤维素酶等）生化法（溶菌酶、纤维素酶等）（二）（二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力吸力(核酸与碱性蛋白的结合核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非、氢键和非极性的范德华力。极性的范德华力。分离核酸分离核酸最困难最困难的是将与核酸紧密结合的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。的蛋白质分开，同时避免核酸降解。常用方法：常用方法：1.加入浓盐溶液（如加入浓盐溶液（如NaCl）核酸核酸-蛋白质加入蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；使氢键破坏，核蛋白解聚；2.加入加入SDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；3.酚酚/氯仿抽提氯仿抽提 酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。作用。在酚在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止为防止起泡和促使水相与有机相的分离起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异，再加上一定量的异戊醇（戊醇（酚：氯仿：异戊酚：氯仿：异戊醇醇=25=25：2424：1 1）。1 1）使用注意）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。酸的磷酸二酯键。2 2）安全操作）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。套。使用酚时应注意使用酚时应注意（三）核酸的沉淀（三）核酸的沉淀 沉淀是浓缩核酸最常用的方法。优点：改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。1.1.核酸沉淀的盐类及浓度核酸沉淀的盐类及浓度盐盐贮存液浓度（贮存液浓度（mol/L)终浓度终浓度(mol/L)MgCl210.01NaAc3(pH5.2)0.3KAc3(pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.82.有机沉淀剂有机沉淀剂 （1 1）乙醇）乙醇优点：优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。挥发除去，不影响以后实验。缺点：缺点：需要量大，一般要求低温操作。需要量大，一般要求低温操作。（2）异丙醇）异丙醇优点：优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNADNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。样品沉淀。一般不需低温长时间放置。缺点缺点：易使盐类、蔗糖与易使盐类、蔗糖与DNADNA共沉淀异丙醇难以挥共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用发除去。所以，最后用7070乙醇漂洗数次。乙醇漂洗数次。（3）聚乙二醇（）聚乙二醇（PEG）优点：优点：可用不同浓度的可用不同浓度的PEGPEG选择沉淀不同相对分子质量选择沉淀不同相对分子质量的的DNADNA片段。应用片段。应用60006000相对分子质量相对分子质量的的PEGPEG进行进行DNADNA沉淀时，使用浓度与沉淀时，使用浓度与DNADNA片段的大小成反比。片段的大小成反比。注意：注意：PEGPEG沉淀一般需要加入沉淀一般需要加入0.5mol/L0.5mol/L的的NaClNaCl或或10mmol/L10mmol/L的的MgClMgCl2 2。要除去。要除去DNADNA沉淀中沉淀中PEGPEG。（4 4）精胺）精胺 精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNADNA。原理是：原理是：精胺与精胺与DNADNA结合后，使结合后，使DNADNA在溶液中结构凝在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与杂质与DNADNA分开，达到纯化分开，达到纯化DNADNA的目的。的目的。3.3.核酸沉淀的温度和时间核酸沉淀的温度和时间 一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀，易导致盐与低温长时间沉淀，易导致盐与DNADNA共沉淀，共沉淀，影响以后的实验。一般使用影响以后的实验。一般使用00冰水，冰水，10-10-15min15min，DNADNA样品足可达到实验要求。样品足可达到实验要求。(四）核酸的浓度测定四）核酸的浓度测定 1.1.紫外分光光度法测定紫外分光光度法测定DNADNA和和RNARNA的含量的含量 前提：前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 g/ml 0.25 g/ml。结论：结论：在波长在波长260nm260nm紫外光下，紫外光下，1 OD1 OD值的吸光度相值的吸光度相当于双链当于双链DNADNA浓度为浓度为50g/ml50g/ml；单链；单链DNADNA为为37 37 g/mlg/ml；RNARNA为为40 ug/ml40 ug/ml。紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤a a吸取一定量的吸取一定量的DNADNA样品或样品或RNARNA样品，加水至特定体积后，转入样品，加水至特定体积后，转入分光光度计的石英比色杯中。分光光度计的石英比色杯中。b b分光光度计先用一定量的水分光光度计先用一定量的水校正零点校正零点。c c测定待测样品在测定待测样品在230nm230nm、260nm260nm和和280nm280nm的的ODOD值。值。d d计算浓度。计算浓度。双链双链DNADNA样品浓度样品浓度(g/l)=OD(g/l)=OD260260核酸稀释倍数核酸稀释倍数 50 50；RNARNA样品浓度样品浓度(g/l)=OD(g/l)=OD260260核酸稀释倍数核酸稀释倍数4040。e e分析纯度。分析纯度。A A：测：测DNADNA：纯的纯的DNADNA样品样品OD260/OD280OD260/OD280应为应为1.81.8，OD260mOD260mOD230OD230应大于应大于2.02.0。1)OD260/OD2801)OD260/OD280大于大于1.91.9时，表明有时，表明有RNARNA污染。污染。2)2)小于小于1.61.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；3)OD260/OD2303)OD260/OD230小于小于2.02.0时，表明溶液中有残存的盐和小时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：注：可能出现既含蛋白质又含可能出现既含蛋白质又含RNARNA的的DNADNA溶液比值为溶液比值为1.81.8的情况。的情况。测定结果分析测定结果分析B B：测：测RNARNA 纯的纯的RNARNA样品其样品其OD260OD260OD280OD280应介于应介于1.7-2.01.7-2.0之间，之间，OD260/OD230OD260/OD230比值应大于比值应大于2.02.0。1 1）若）若RNARNA样品样品OD260/OD280OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；酚的污染；2 2）比值大于）比值大于2.02.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；时，可能被异硫氰酸胍等污染；3 3）OD260/OD230OD260/OD230比值小于比值小于2.02.0时表明有小分子及盐存在。时表明有小分子及盐存在。2.2.溴乙锭荧光法测定核酸的含量溴乙锭荧光法测定核酸的含量 如果如果DNADNA和和RNARNA的量很少或有较多杂质的情况下，其的量很少或有较多杂质的情况下，其含量可用溴乙锭荧光法测定。含量可用溴乙锭荧光法测定。原理：原理：DNADNA、RNARNA本身并不产生荧光，但在荧光染料溴乙锭本身并不产生荧光，但在荧光染料溴乙锭(EB)(EB)嵌入碱基平面之间后，嵌入碱基平面之间后，DNADNA样品在紫外光激发下，样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度系列已知的不同浓度DNADNA溶液作标准对照，可比较出被溶液作标准对照，可比较出被测测DNADNA溶液浓度。溶液浓度。注意：注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。此法的比较主要基于目测，是估计水平。（五）核酸的保存（五）核酸的保存1 1对对DNADNA保存：保存：DNADNA样品溶于样品溶于pH8.0pH8.0的的TETE，4 4 或或-20-20 保存；保存；长期保存样品中可加入长期保存样品中可加入1 1滴氯仿。滴氯仿。2 2对对RNARNA 保存：保存：RNARNA样品溶于样品溶于0.3 mol/L NaAc(pH5.2)0.3 mol/L NaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，或双蒸灭菌水中，-70 70 保存保存;长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;在在RNARNA溶液中，加溶液中，加1 1滴滴0.2 mol/L VRC(0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物氧钒核糖核苷复合物)冻贮于冻贮于-70,-70,可保存数年。可保存数年。总RNA提取目的1了解某一特定组织或细胞某一特定mRNA转录量的变化，如PCR、Northernblot等。2了解某一特定组织或细胞全部mRNA转录量的变化，如DD-PCR、基因芯片等。3获得某一特定组织或细胞全部mRNA，以便建立cDNA库等。4获得某一特定组织或细胞全部RNA。以上工作的前提是制备纯净且完整的RNA。根据生物学“中心法则”原理，基因的表达包括转录与翻译两个阶段。其中，由DNA到RNA的转录过程受到各种因素的调节，其调节水平反映出某种或某些特定的因素对相关基因表达的调节能力。RNA主要由rRNA（占总量的80-85），tRNA和核内小分子RNA（占总量的10-15）以及mRNA（占总量的1-5）所构成。理论上认为每克组织（或108个培养细胞）可提取5-10mgRNA。提取总RNA的方法有多种，比如：1)酚酚/SDS/SDS法法 2）采用Trizol试剂盒或类似的方法，称为一步法，方便而快捷。缺点是RNA的获得量偏低，质量不够纯净。3）超离心方法，可以获得丰富且质量高的RNA。缺点是实验时间比较长，要求离心过夜。4）其它一些试剂盒，主要是利用某些特定的介质吸附RNA，洗去其它杂质，最后洗脱纯净的RNA。可以在短时间内获得纯净的RNA。但是价格比较昂贵。植物总RNA提取(酚酚/SDS法法)材料材料液氮液氮研磨缓冲液：研磨缓冲液：0.18mol/LTris0.09mol/LLiCL4.5mmol/LEDTA1%（W/V）SDS用HCL调PH至8.21mol/LTris的配法：在800双蒸水中溶解121克Tris碱，用浓盐酸调PH值，混匀后加水至1升。要获得所需PH值的1M Tris HCL，可通过将一定数量的10M HCL和1升Tris碱混合，如下表所示:PH，2510mol/LHCL(ml)PH 2510mol/LHCL(ml)PH 2510mol/LHCL(ml)7.289.47.869.08.434.47.386.87.964.08.529.47.484.08.058.48.624.87.580.68.152.48.720.67.677.08.245.88.817.07.773.28.339.88.914.00.5MEDTA的配制：在700ML双蒸水中溶解186.1克Na2EDTA.2H2O，用NaOH调PH8.0（1000ML05MEDTA需加入20克NaOH），补加双蒸水至1升。TLE缓冲液平衡酚缓冲液平衡酚TLE溶液溶液:0.2mol/LTris0.1mol/LLiCL5mmol/LEDTA用HCL调PH至8.2，用等体积的PH8.0的TLE溶液抽提，然后再用TLE溶液至少抽提2次氯仿：异戍醇（氯仿：异戍醇（24：1）8MOL/L和和2MOL/L LICL溶液（溶液（DEPC处理，处理，焦碳酸二乙酯）焦碳酸二乙酯）3MOL/L乙酸钠（乙酸钠（DEPC处理），将处理），将408克克NaAc.3H2O溶于水，用溶于水，用3MOL/L乙酸调乙酸调PH5.2，补加水至，补加水至1升升95%乙醇乙醇DEPC处理水处理水试验步骤：试验步骤：1、用液氮冷却研钵，取用液氮冷却研钵，取15g低温冷冻的植物组织，迅低温冷冻的植物组织，迅速置于研钵中，不时加入液氮以防止研磨过程中叶片速置于研钵中，不时加入液氮以防止研磨过程中叶片融化，充分研磨后，立即转移到一个盛有融化，充分研磨后，立即转移到一个盛有150ML研磨研磨缓冲液和缓冲液和50ml TLE缓冲液平衡酚的缓冲液平衡酚的500ml离心管中。离心管中。2、加入加入50ml氯仿：异戍醇，于氯仿：异戍醇，于50加热加热20 min。18000g,4，离心，离心20 min。3 3、将上层水相转移到一个新的离心管中，、将上层水相转移到一个新的离心管中，加入加入50ml TLE50ml TLE缓冲液平衡酚的缓冲液平衡酚的500ml500ml，混，混匀，再加入匀，再加入50ml50ml氯仿：异戍醇，氯仿：异戍醇，18000g,18000g,44，离心，离心20 min20 min。4、用、用 TLE缓冲液平衡酚抽提水相，直至两面相间界面缓冲液平衡酚抽提水相，直至两面相间界面干净为止，水相再以氯仿抽提。干净为止，水相再以氯仿抽提。5、吸取上清液，加吸取上清液，加1/3体积的体积的8M/L LiCL混合至终浓混合至终浓度为度为2M/L，4沉淀过夜，然后沉淀过夜，然后15000g，4，离心离心20 min，沉淀以，沉淀以2-3ml 2M/L LiCL溶液冲洗。溶液冲洗。6、沉淀以、沉淀以5ml水重溶，加入水重溶，加入1/3体积的体积的8M/L LiCL混合混合至终浓度为至终浓度为2M/L，于，于 4深沉深沉RNA两小时以上。两小时以上。7、15000g，4，离心离心20 min，沉淀用，沉淀用2ml 2M/L LiCL溶液冲洗，重溶于溶液冲洗，重溶于2ml双蒸水，加双蒸水，加入入200ul 3MOL/L乙酸钠溶液和乙酸钠溶液和5.5ml无水乙醇，无水乙醇，-20沉淀过夜或在干冰沉淀过夜或在干冰/乙醇中沉淀乙醇中沉淀30 min。8、18000g,4，离心，离心15min，沉淀用，沉淀用1ml双蒸双蒸水溶解，取水溶解，取10 ul稀释至稀释至1ml测测OD260和和OD280Trizol试剂盒方法原理本实验类似于“异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法”。方法采用强RNA酶抑制剂异硫氰酸胍，抑制RNA酶的活性，防止RNA的降解；酚/氯仿使蛋白质变性。离心后，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相。之后通过异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤等，便可得到较为完整与纯洁的总RNA。实验步骤1取50毫克植物细嫩组织，加入1mlTrizol液，剪碎，快速匀浆。222，静置5min。3加入氯仿0.2ml，颠倒15s。422，静置3min。5离心：415000转/分15min。6取上清液0.45ml。7加入0.45ml异丙醇，混匀。822，静置10min。9离心：415000转/分10min。10弃上液。11加入1ml475%乙醇。12离心：410000转/分5min。13弃上液，真空干燥5min。14用高压消毒过的去离子水25ul水冰上溶解，-70保存。15紫外分光光度计测定RNA的含量：取样本5ul加入石英比色杯内，加入蒸水1ml，充分混匀。与蒸镏水对照。读260nm、280nm两个测得值，记录。计算：OD260为1时，为40ugRNA，所以计算如下：样本RNA含量（ug/ul）=OD260*200*40/1000当OD值260/28030min;20过夜将有助于增加核酸的沉淀量。9、在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水因此时离子浓度可能较高，而到高度纯化后低温保存时最好复溶于TE缓冲液中，因溶于TE的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸样品保存时要求以高浓度保存，低浓度的核酸样品要比高浓度的更易降解。10、核酸提取后可通过PCR、RTPCR直接扩增出目的基因片断，也可首先构建文库、然后由dd-PCR等差异显示技术、AFLP等标记技术、差异杂交或文库扣除技术等方法筛选出特异探针，再用此探针从文库中筛选出完整基因。11、在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以增加抽提次数.提取RNA请尽量在低温下操作，如果条件不容许，在室温下操作的时间要尽可能的短。克服多糖污染可采用以下一些办法1)CTAB多次抽提。2)在有机溶剂沉淀时先稀释样品浓度（可到10倍左右），对低浓度样品再进行沉淀。3)在有机溶剂沉淀时选用异丙醇和5MNaCL作为沉淀溶剂，此时氯化钠的用量可用到1/5-1/2的体积，异丙醇可用到0.6-1的体积。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。针对RNA酶的一些注意事项防止RNA酶污染的措施：1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6hr或更长时间。2、塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3、有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。4、配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌。5、操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6、设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。7、DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理8、加样原则是DNA最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染。9、普通实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备