功能位点分析.pptx

生物信息学生物信息学核酸序列的一般分析核酸序列的一般分析主讲教师：王主讲教师：王 莉莉主要内容：主要内容：一、基因组一、基因组DNA简介简介二、序列格式转化二、序列格式转化三、三、DNA序列分析序列分析四、序列翻译、四、序列翻译、ORF查找查找五、限制性内切酶分析五、限制性内切酶分析六、引物设计六、引物设计七、七、RNA二级结构分析二级结构分析一、基因组一、基因组DNA简介简介 遗传信息存贮在遗传信息存贮在4种字符组成的核酸序列中种字符组成的核酸序列中 “天书天书”用遗传语言书写的人类遗传蓝本用遗传语言书写的人类遗传蓝本包含的信息量巨大包含的信息量巨大更重要的是目前人类对它了解甚少更重要的是目前人类对它了解甚少天书中只有天书中只有4个字符（碱基个字符（碱基A、T、G、C）既没有段落，也没有标点符号既没有段落，也没有标点符号是一个长度为是一个长度为3109的一维序列。的一维序列。科学家对这本天书了解最多的部分就是遗传密码科学家对这本天书了解最多的部分就是遗传密码或者说掌握了或者说掌握了DNA对蛋白质编码的规律对蛋白质编码的规律 关于密码子关于密码子（1）密码子的使用是非随机的）密码子的使用是非随机的 如果密码子的第一、第二位碱基是如果密码子的第一、第二位碱基是A、U，那么第三位将尽可能使用那么第三位将尽可能使用G、C；反之亦然。；反之亦然。如果三位都用如果三位都用G、C，则配对容易，分解难；，则配对容易，分解难；三位都用三位都用A、U，则相反。，则相反。一般地说，高表达的基因，要求翻译速度快，一般地说，高表达的基因，要求翻译速度快，要求密码子和反密码子配对快、分开也快。要求密码子和反密码子配对快、分开也快。（2）密码子的使用有一定的统计规律）密码子的使用有一定的统计规律 对同义密码子的使用存在着偏爱对同义密码子的使用存在着偏爱不同种属偏爱的密码子不同不同种属偏爱的密码子不同人类基因组：人类基因组：密码子第三位取密码子第三位取A、U的情况占的情况占90%而第三位取而第三位取G、C仅占仅占10%密码子的使用偏性与基因功能、蛋白质结构相关密码子的使用偏性与基因功能、蛋白质结构相关（3）密码子中的密码密码子中的密码 三个碱基的位置与所编码的氨基酸性质存在着联系三个碱基的位置与所编码的氨基酸性质存在着联系例如：例如：芳香族氨基酸芳香族氨基酸以以U作为第一位碱基作为第一位碱基中间位置碱基的性质与氨基酸是亲疏水性相关中间位置碱基的性质与氨基酸是亲疏水性相关疏水氨基酸的密码子，其第二位碱基是疏水氨基酸的密码子，其第二位碱基是U亲水氨基酸的密码子，其第二位碱基是亲水氨基酸的密码子，其第二位碱基是A第二位碱基是第二位碱基是G、C的密码子所编码的氨基酸的密码子所编码的氨基酸 亲水性、疏水性居中。亲水性、疏水性居中。人类基因组信息：人类基因组信息：编码区域只占编码区域只占1%-3%对于非编码序列，尚不清楚其含义或功能对于非编码序列，尚不清楚其含义或功能非编码区域对于生命活动具有重要的意义非编码区域对于生命活动具有重要的意义 包括内含子、简单重复序列、移动元件、伪基因包括内含子、简单重复序列、移动元件、伪基因 重复序列重复序列:卫星（卫星（satellite）DNA 小卫星（小卫星（mini-satellite）DNA 微卫星（微卫星（micro-satellite）顺式调控元件顺式调控元件:启动子、增强子、沉默子启动子、增强子、沉默子关于生物复杂性：关于生物复杂性：生物的复杂性不仅仅是基因的数目生物的复杂性不仅仅是基因的数目 人类基因约为人类基因约为30000个个 线虫有线虫有20000个基因个基因230000/220000=210000103000 基因组计划带来的希望：基因组计划带来的希望：实验数据的积累速度在迅速地增加实验数据的积累速度在迅速地增加 计算机科学和技术也在不断地发展计算机科学和技术也在不断地发展 单个基因组分析：单个基因组分析：基因序列基因序列基因功能基因功能基因的表达调控基因的表达调控基因产物基因产物基因多态性基因多态性比较基因组分析：比较基因组分析：物种关系物种关系物种进化物种进化物种起源物种起源二、序列格式转化二、序列格式转化 各各种种软软件件为为了了自自己己的的需需要要，通通常常对对序序列列格格式式有有一一定定的的要要求求，给给我我们们的的使使用用带带来来了了一一定定的的困困难难。格格式式转转换换软软件件可可以以将将不不同同格格式式数数据据转转换换以以方方便便使使用用。很很多多综综合合性性软软件件可可以以进进行行序序列列格格式式转转换换，如如DNAstar，seqverter等。等。常见序列格式：常见序列格式：（1）FASTA格式（又称格式（又称Pearson格式）格式）是是比比较较简简单单而而使使用用最最多多的的序序列列格格式式。序序列列以以号号开开头头，其其后后是是单单行行的的关关于于序序列列的的描描述述信信息息，最后是序列。例子：最后是序列。例子：10KD_VIGUN P18646 vigna unguiculata 10 kda protein precursor MEKKSIAGLCFLFLVLFVAQEVVVQSEAKTCENLVDTYRGPCFTTGSCDDHCKNKEHLLS（2）Genbank格式（格式（GenBank flatfile，GBFF）最最广广泛泛地地用用于于表表示示生生物物序序列列的的格格式式之之一一，也也是是DDBJ/EMBL/GenBank交换数据时采用的格式。交换数据时采用的格式。例如：例如：LOCUS AB094638_1 146 bp DNA 13-APR-2006 BASE COUNT 38 a 17 c 43 g 48 t 0 others ORIGIN 1 gttttaatgt gttgccttgg ttgagtggtg aagctggtta gggtagcgtg taaaacatgg 61 tgggtagatt aatgctttgt gtcaccatgc cgtttggttc gattaatgta atcataagga 121 gagaccataa gttatgaata cgcaga（3）EBML格式格式 与与GBFF格格式式的的主主要要区区别别是是：每每行行左左端端均均有有由由两两个个大大写写字字母母组组成成的的识识别别标标志志，是是GenBank识识别标志的缩写。另外，序列的序号在右侧。别标志的缩写。另外，序列的序号在右侧。（4）GCG格格式式：是是商商业业性性的的GCG软软件件包包的的专专用用格式。格式。最新下载最新下载 http:/ *下载后直接安装即可下载后直接安装即可Seqverter三、三、DNA序列分析序列分析基因序列基因表达调控信息 寻找基因涉及到两个方面的工作寻找基因涉及到两个方面的工作：识别与基因相关的特殊序列信号预测基因的编码区域 结合两个方面的结果确定基因的位置和结构 基因表达调控信息隐藏在基因的上游区域，在组成上具有一定的特征，可以通过序列分析识别这些特征。1.DNA序列分析步骤序列分析步骤在DNA序列中，除了基因之外，还包含许多其它信息，这些信息大部分与核酸的结构特征相关联，通常决定了DNA与蛋白质或者DNA与RNA的相互作用。存放这些信息的DNA片段称为功能位点如 启 动 子（Promoter）、基 因 终 止 序 列（Terminator sequence）、剪切位点（Splice site）等。发现重复序列发现重复序列数据库搜索数据库搜索分析功能位点分析功能位点序列组成统计分析序列组成统计分析综合分析综合分析一个基本的一个基本的DNA序列分析方案序列分析方案2.核苷酸关联分析核苷酸关联分析对于一个给定的基因组，最简单的计算就是统计DNA序列中各类核苷酸出现的频率对于随机分布的DNA序列，每种核苷酸的出现是均匀分布的出现频率各为0.25。而真实基因组的核苷酸分布则是非均匀的核苷酸核苷酸 频率频率 A0.3248693727808 C0.1751306272192 G0.1751306272192 T0.3248693727808 酵母基因组核苷酸出现频率酵母基因组核苷酸出现频率在统计过程中，如果同时计算DNA的正反两条链，则根据碱基配对原则，A和T、C和G的出现频率相同。如果仅统计一条链，则虽然A和T、C和G的出现频率不同，但是非常接近。两联核苷酸频率：两联核苷酸频率：不同基因组中两个连续核苷酸出现的频率也是不相同的4种核苷酸可以组合成16种两联核苷酸酵母基因组两联核苷酸频率表酵母基因组两联核苷酸频率表对酵母基因组两对酵母基因组两联核苷酸的统计联核苷酸的统计结果结果其中核苷酸对出其中核苷酸对出现频率最高的达现频率最高的达到到0.119而出现频率最低而出现频率最低的只有的只有0.028三联核苷酸三联核苷酸基因密码子：基因密码子：在进行编码区域识别时，常常需要对三联核苷酸进行统计分析，这实际上是分析密码子的使用偏性。由于密码子的简并性（degeneracy），每个氨基酸至少对应1种密码子，最多有6种对应的密码子。在基因中，同义密码子的使用并不是完全一致的。不同物种、不同生物体的基因密码子使用存在着很大的差异基因密码子的使用与基因编码的蛋白的结构和功能有关，与基因表达的生理功能有着密切的联系 蛋白的三级结构与密码子使用概率有密切的关系通过对密码子的聚类分析，可以很清晰地将具有不同三级结构蛋白质的编码基因分成不同的类，而具有相似三级结构蛋白的编码基因则大致聚在同一类中，从而证明基因密码子的使用偏性与蛋白质三级结构具有密切的相关性。在不同物种中，类型相同的基因具有相近的同义密码子使用偏性对于同一类型的基因由物种引起的同义密码子使用偏性的差异较小 3.功能位点分析功能位点分析功能位点（functional site）与特定功能相关的位点，是生物分子序列上的一个功能单元，或者是生物分子序列上一个较短的片段。功能位点又称为功能序列（functional sequence）、序列模式（motif）、信号（signal）等。核酸序列中的功能位点包括转录因子结合位点、转录剪切位点、翻译起始位点等。在蛋白质序列分析中，常使用序列模式这个名词，蛋白质的序列模式往往与蛋白质结构域或者作用部位有关。功能位点示意功能位点示意基因组序列中若干个相邻的功能位点组合形成功能区域（functional region）。功能位点分析的任务发现功能位点特征识别功能位点四、序列翻译、四、序列翻译、ORF查找查找 对对于于一一条条新新的的核核酸酸序序列列，除除了了对对数数据据库库进进行行类类似似性性检检索索和和同同源源性性比比较较外外，还还有有许许多多其其他他分分析析内内容容。例例如如：计计算算DNADNA的的碱碱基基组组成成、检检索索内内部部重重复复序序列列、检检索索DNADNA的的特特殊殊位位点点或或信信号号、开开放放读读框框的的查查找、鉴定找、鉴定DNADNA的编码区和翻译基因序列等。的编码区和翻译基因序列等。基基因因编编码码区区是是指指可可以以由由核核糖糖体体翻翻译译成成蛋蛋白白质质的的序序列列，它它的的5端端有有转转录录和和翻翻译译的的起起始始位位点点，3端端有有终终止止位位点点。基基因因的的起起始始位位点点通通常常是是ATG，终止位点为终止位点为TAA、TAG、TGA。一一个个起起始始和和终终止止密密码码子子之之间间的的序序列列称称为为一一个个开开放放阅阅读读框框（Open Reading Frame，简简称称ORF），它是一个潜在的蛋白质编码区。），它是一个潜在的蛋白质编码区。对于任何给定的核酸序列（单链DNA或mRNA），根据密码子的起始位置，可以按照三种方式进行阅读。例如，序列ATTCGATCGCAA这三种阅读顺序称为阅读框（reading frames）CAA A ATTCGATCGATTCGATCGCAATCGATCGCA（1）（3）（2）AT基因可变剪切示意图基因可变剪切示意图gene A基因可变剪切示意图基因可变剪切示意图序列翻译、序列翻译、ORF查找查找1.Generunnerhttp:/2.在线的在线的ORF finderhttp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html功能：功能：序序列列编编辑辑与与类类似似序序列列查查找找、建建立立自自己己的的序序列列数数据据库库进进行行查查找找、序序列列比比较较、序序列列翻翻译译、蛋蛋白白序序列列分分析析等等，还还包包括括DNA分分析析常常用用到到的的一一些些功功能能，如如碱碱基基百百分分组组成成、分分子量计算等。子量计算等。Generunner http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.htmlORF finder输入序列输入序列在在Enter GI or ACCESSION 后后面面的的框框中中输输入入公公共共序序列列的的gi号或号或ACCESSION号号在在or sequence in FASTA format 后后面面的的框框中中输输入入完完整整的序列的序列设设置置序序列列范范围围 在在FROM:TO:后后面面的的框框中中输输入入进进行行ORF查找的序列范围查找的序列范围Genetic codes 可以选择采用何种遗传编码可以选择采用何种遗传编码按按OrfFind 按钮即可执行按钮即可执行 限限制制性性内内切切酶酶是是在在许许多多细细菌菌体体内内发发现现的的能能识识别别和和切切割割外外源源DNA的的核核酸酸酶酶。细细菌菌自自身身的的DNA因因其其限限制制型型内内切切酶酶的的识识别别位位点点被被相相应应的的DNA甲甲基基化化酶酶所所甲甲基基化化，而而不不被被内内切切酶酶所所水水解解。限限制制型型内内切切酶酶的的这这种种作作用用使使之之成成为为遗遗传传工工程程实实验验的的重重要要工工具酶之一。具酶之一。五、限制性内切酶分析五、限制性内切酶分析 每每一一种种限限制制性性内内切切酶酶都都有有特特定定的的DNA识识别别顺顺序序，并并且且呈呈回回文文排排列列。确确定定DNA酶酶切切位位点点是是基基因因操操作作的的必必不不可可少少的的步步骤骤，因因此此DNA序序列列分分析析软软件件包包大大多多整整合合有有检检索索酶酶切切位位点点的的程程序序。这这些些程程序序附附带带一一个个酶酶切切位位点点的的数数据据库库文文件件，根根据据这这个个文件对序列作酶切位点的查找。文件对序列作酶切位点的查找。RESTRICTION ANALYSISDNAssist 1.02DFW 2.21Generunner下载地址：下载地址：http:/biosoft.biosino.org/dna.html限制性内切酶分析常用软件限制性内切酶分析常用软件Dnastar1.序列格式转换序列格式转换2.限制性内切酶分析限制性内切酶分析3.序列拼接序列拼接下载网址：下载网址：http:/ 从从原原理理来来说说，引引物物的的设设计计和和分分析析并并不不是是DNA序序列列分分析析的的一一个个基基本本方方法法，但但是是在在分分子子生生物物学学研研究究中中常常常常需需要要用用到到。我我们们主主要要介介绍绍针针对对PCR的的引引物设计。物设计。六、引物设计六、引物设计引物设计的标准有：引物设计的标准有：引物的长度通常为引物的长度通常为20-30个碱基个碱基引物避免有发卡结构引物避免有发卡结构引物避免有彼此之间的互补配对引物避免有彼此之间的互补配对两个引物之间避免有类似序列两个引物之间避免有类似序列引物与核酸序列数据库的其他序列无明显类似引物与核酸序列数据库的其他序列无明显类似引物引物5端能加上合适的酶切位点端能加上合适的酶切位点引引物物组组成成均均匀匀，避避免免含含有有相相同同碱碱基基的的多多聚聚体体，两个引物的两个引物的GC含量近似含量近似 可可见见，引引物物设设计计包包含含序序列列组组成成的的计计算算、序序列列对对DNA序序列列数数据据库库的的类类似似性性检检索索、两两个个序序列列的的比比较较、碱碱基基互互补补配配对对和和发发卡卡结结构构分分析析以以及及酶酶切切位位点点检检索索等等基基本本的的DNA序序列列分分析析过过程程。事事实实上上，许许多多PCR引引物物设设计计程程序序会会略略过过或或简简化化上上述述的的某某些过程。些过程。Primer Premier 5.0下载下载http:/ 执行安装程序即可执行安装程序即可*下载的为下载的为demo版，只能对它的示例序列进行操作版，只能对它的示例序列进行操作在在C盘盘下下找找到到WIN.INI，将将vspace=DU改改为为vspace=PU便便可以使用全部功能。可以使用全部功能。功能功能 可可以以简简单单地地通通过过手手动动拖拖动动鼠鼠标标以以扩扩增增出出相相应应片片段段所所需需的的引引物物，而而在在手手动动的的任任何何时时候候，下下面面显显示示各各种种参参数数的的改改变变和和可可能能的的二二聚聚体体、异异二二聚聚体体、发发夹夹结结构构等等。也也可可以以给给定定条条件件，让让软软件件自自动动搜搜索索引引物物，并并将将引引物物分分析析结结果果显显示示出出来来。而而且且进进行行这这些操作非常简单。些操作非常简单。Primer Premier 5.0其他引物设计软件：其他引物设计软件：Primer3http:/www-genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.htmlDNAClubhttp:/www.bio- 2+（G+C）X 4，退退火火温温度度为为Tm-73.G+C%=40-60%4.5、3 引物退火温度最好相等；引物退火温度最好相等；5.四个相同的碱基相连最好不要出现；四个相同的碱基相连最好不要出现；6.引物的最后一个避免为引物的最后一个避免为T。实际引物设计采用的几条原则实际引物设计采用的几条原则 无无论论是是mRNA、rRNA还还是是tRNA，它它们们的的功功能能最最终终是是由由它它们们的的折折叠叠结结构构来来决决定定的的，尽尽管管这这种种折折叠叠的的结结构构依依赖赖于于它它的的序序列列，但但是是它它不不仅仅仅仅由由序序列列来来确确定定。当当前前准准确确测测定定RNA折折叠叠结结构构还还有有赖赖于于X射射线线衍衍射射技技术术，但但是是很很难难获获得得RNA分分子子晶晶体体，所所以以测测定定的的结结构构非非常常少少。因因此此，人人们们希希望望能能通通过过RNA的序列来预测其结构，首先是二级结构。的序列来预测其结构，首先是二级结构。七、七、RNA二级结构分析二级结构分析 RNA分分子子通通过过分分子子内内的的碱碱基基配配对对而而折折叠叠，碱碱基基对对的的氢氢键键以以及及它它们们形形成成的的局局部部螺螺旋旋的的堆堆积积力力起起着着稳稳定定的的作作用用，即即降降低低折折叠叠结结构构的的自自由由能能。RNA中中能能形形成成的的碱碱基基对对包包括括GC，AU、GU，他他们们分分别别有有3个个，2个个，和和一一个个氢氢键键。分分子子的的螺螺旋旋区区形形成成茎茎（stem），那那些些不不构构成成互互补补配配对对的的单单链链碱碱基基形形成成环环（loop）。因因此此，预预测测RNA二二级级结结构构的的一一个个很很自自然然的的方方法法是是寻寻找找最最大大数数目目的的碱碱基基配配对对和和计计算算RNA分分子子的最低自由能。的最低自由能。Rnastructure最新下载最新下载 http:/rna.chem.rochester.edu/register.html*下载后直接安装即可下载后直接安装即可Rnastructure RNAdraw Rnastructure RNA Sturcture 根根据据最最小小自自由由能能原原理理，将将Zuker的的根根据据RNA一一级级序序列列预预测测RNA二二级级结结构构的的算算法法在在软软件件上上实实现现。预预测测所所用用的的热热力力学学数数据据是是最最近近由由Turner实实验验室室获获得得。提提供供了了一一些些模模块块以以扩扩展展Zuker算算法法的的能能力力，使使之之为为一一个个界界面面友友好好的的RNA折叠程序。折叠程序。Rnastructure