天美公司LC高效液相色谱仪水行业.pptx
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1、液相历史现状简介液相历史现状简介液相色谱的简史及现状液相色谱的简史及现状(一)(一)液相色谱的雏形液相色谱的雏形 薄层色谱薄层色谱经典的液相色谱制备色谱的雏形制备色谱的雏形1、早在古罗马时期,人们就知道将一滴混合色素的溶液滴在一块布或一张纸上,观察溶液展开产生的一个个同心圆来分析染料和色素。2、1906年,俄国植物学家茨年,俄国植物学家茨维特使用图所示的装置分离维特使用图所示的装置分离绿叶素,柱管是采用碳酸钙,绿叶素,柱管是采用碳酸钙,溶剂加在上端,在地球引力溶剂加在上端,在地球引力的作用下迁移,而组分的检的作用下迁移,而组分的检测则依靠肉眼的观察。测则依靠肉眼的观察。2020多年后,人们又成
2、功多年后,人们又成功地用液相色谱证实了蛋地用液相色谱证实了蛋黄内的叶黄素是植物叶黄内的叶黄素是植物叶黄素和玉米黄的混合物,黄素和玉米黄的混合物,这就是今天制备色谱提这就是今天制备色谱提纯的雏形纯的雏形气相色谱理论的引入第一台液相色谱的诞生液相色谱的现状液相色谱的简史及现状液相色谱的简史及现状(二)(二)19601960年代末世界上第年代末世界上第一台液相色谱诞生,一台液相色谱诞生,开启了液相色谱的时开启了液相色谱的时代。代。采用高压泵输送采用高压泵输送流动相代替重力作用,流动相代替重力作用,使柱效率提高,加快使柱效率提高,加快分析速度;而柱分离分析速度;而柱分离技术与光学检测器相技术与光学检测
3、器相结合也使得液相色谱结合也使得液相色谱由最初的以分离目的由最初的以分离目的为主发展成为可以同为主发展成为可以同时完成时完成分离分析分离分析目的目的的重要分析方法。的重要分析方法。19601960年代,由于气相年代,由于气相色谱对高沸点有机物色谱对高沸点有机物分析的局限性,为了分析的局限性,为了分离蛋白质、核酸等分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物不易气化的大分子物质,气相色谱的理论质,气相色谱的理论和方法被重新引入经和方法被重新引入经典液相色谱,研制成典液相色谱,研制成功多种细粒度高效填功多种细粒度高效填充柱,大大提高了液充柱,大大提高了液相色谱的分离能力。相色谱的分离能力。1、食品安全、药
4、品安全、环境卫生、生命科学等都需要液相色谱2、液相色谱占全世界分析仪器市场销售总额近20%,而且每年按10%左右的增长率稳步上升。3、液相色谱的发展朝着更加自动化,智能化、和其它仪器联用技术方向发展,比如液相和质谱联用,液相和红外联用,以利于更快速、更准确的定性、定量分析。OUTINABCDLOCKOFF检测器器!BeLOCKOFF自自动进样器器LOCKOFF溶溶剂箱箱高高压泵单元元液相色谱的简史及现状液相色谱的简史及现状(三)(三)液相色谱整体及概念液相色谱整体及概念分析柱分析柱六通阀六通阀检测器检测器废液瓶废液瓶保护柱保护柱流动相在线脱气比例电磁阀输液泵输液泵排放阀混合器液相色谱的流程图梯
5、度篇液相色谱的基本概念(一)液相色谱的基本概念(一)高分离度液相液相色谱的叫法高效液相色谱高压液相色谱高速液相色谱液相色谱的几个重要概念(二)液相色谱的几个重要概念(二)一、液相色谱和气相色谱的区别分析对象分离的形式液相色谱气相色谱 适用分离分子量小的,适用分离分子量小的,挥发性化合物。如蔬菜、挥发性化合物。如蔬菜、水果中有机磷的农药残留,水果中有机磷的农药残留,茶叶中有机氯,引用水中茶叶中有机氯,引用水中三氯甲烷、四氯化碳检测三氯甲烷、四氯化碳检测 适用分离大适用分离大分子量的,低挥分子量的,低挥发性或不挥发、发性或不挥发、热稳定性差的物热稳定性差的物质,如食品添加质,如食品添加剂、色素、苏
6、丹剂、色素、苏丹红等等红等等样品形式 主要是通过改主要是通过改变流动比例,改变流变流动比例,改变流动相的洗脱强度,从动相的洗脱强度,从而达到分离,色谱柱而达到分离,色谱柱最常用的是最常用的是C18C18这一这一类柱,还有氨基柱、类柱,还有氨基柱、氰基柱等,色谱柱种氰基柱等,色谱柱种类少。类少。主要是通过色谱柱的不同极性来进行分离,从非极性到中等极性,再到强极性,做一类样品需要一根专用的色谱柱,所以有很多的色谱柱,使用成本较高。样品形式为:液体样品形式为:液体既可以分析气体,既可以分析气体,也可以分析液体也可以分析液体液相色谱的几个重要概念(三)液相色谱的几个重要概念(三)分析对象固定相区别出峰
7、顺序 常用于分离中常用于分离中等极性和极性等极性和极性较强的化合物较强的化合物(如酚类、胺(如酚类、胺类、羰基类及类、羰基类及氨基酸类等)氨基酸类等)适用于分离非极适用于分离非极性和弱极性的化性和弱极性的化合物,此种色谱合物,此种色谱应用最为广泛,应用最为广泛,它占整个液相色它占整个液相色谱应用的谱应用的80%80%左右。左右。反相色谱正相色谱固定相为极性的,固定相为极性的,流动相为非极性流动相为非极性(如氨基柱、氰基(如氨基柱、氰基柱,流动相为正己柱,流动相为正己烷、环己烷等,常烷、环己烷等,常加入乙醇、异丙醇加入乙醇、异丙醇等以调节组分的保等以调节组分的保留时间留时间固定相为非极性的固定相
8、为非极性的(C18C18、C8C8),流),流动相极性的动相极性的(如水如水或缓冲液,常加入或缓冲液,常加入甲醇、乙腈等有机甲醇、乙腈等有机溶剂调节保留时间溶剂调节保留时间极性大的物质极性大的物质先出峰。先出峰。极性小物质极性小物质先出峰。先出峰。梯度和等度的区别梯度和等度的区别(四)(四)(四)(四)等度模式梯度模式高压梯度和低压梯度的区别高压梯度和低压梯度的区别(五)(五)LOCK OFF!BeLOCK OFFOUTINABCDOUTINABCDLOCK OFF溶溶剂箱箱检测器器柱温箱柱温箱自自动进样器器泵2 泵 1OUTINABCDLOCK OFF检测器器!BeLOCK OFF自自动进样
9、器器LOCK OFF溶溶剂箱箱高高压泵单元元高压梯度低压梯度高压梯度和低压梯度的区别高压梯度和低压梯度的区别(五)(五)高压梯度和低压梯度的区别高压梯度和低压梯度的区别(五)(五)高压梯度LOCK OFF!BeLOCK OFFOUTINABCDOUTINABCDLOCK OFF溶溶剂箱箱检测器器柱温箱柱温箱自自动进样器器泵2 泵 1工作过程采用两个或多个高压泵将采用两个或多个高压泵将不同的溶剂分别增压后输不同的溶剂分别增压后输送到同一个梯度混合器进送到同一个梯度混合器进行混合,混合后的流动相行混合,混合后的流动相再进入进样阀和色谱柱的再进入进样阀和色谱柱的方法。方法。优点优点1 1、可获得任意
10、形式的梯、可获得任意形式的梯度洗脱曲线,精度高。梯度洗脱曲线,精度高。梯度方式度方式 可以是连续的,可以是连续的,也可以是分段台阶式的,也可以是分段台阶式的,还可以是凹形或凸形的,还可以是凹形或凸形的,实际中应用较少。实际中应用较少。2 2、不同组分的溶剂在高、不同组分的溶剂在高压下混合,不易产生气泡,压下混合,不易产生气泡,对流动相的脱气要求相对对流动相的脱气要求相对较低较低缺点:缺点:1 1、高压梯度需使用多台高压输、高压梯度需使用多台高压输液泵,流动相需要变化几种组分液泵,流动相需要变化几种组分即需要几台高压输液泵,即所说即需要几台高压输液泵,即所说的几元梯度,如二元梯度需要两的几元梯度
11、,如二元梯度需要两台输液泵,三元需要三台泵,成台输液泵,三元需要三台泵,成本高。本高。2 2、梯度曲线与设定值可能会、梯度曲线与设定值可能会存在一定的滞后和偏离,因为大存在一定的滞后和偏离,因为大部分液体的压缩性为每增加部分液体的压缩性为每增加105 105 PaPa压力导致压力导致0.01%0.015%0.01%0.015%的体积的体积减小,加上某些溶剂混合时还伴减小,加上某些溶剂混合时还伴随着体积变化,所以会导致梯度随着体积变化,所以会导致梯度曲线与设定值可能会存在一定的曲线与设定值可能会存在一定的滞后和偏离。滞后和偏离。OUTINABCDLOCK OFF检测器器!BeLOCK OFF自自
12、动进样器器LOCK OFF溶溶剂箱箱高高压泵单元元低压梯度高压梯度和低压梯度的区别高压梯度和低压梯度的区别(五)(五)工作过程在常压下,将不同组分的溶剂混合后,再用高压输液泵送入进样阀和色谱柱的方法。优点1 1、采用一台高压输液泵,结合、采用一台高压输液泵,结合电磁比例阀就可以完成多元梯电磁比例阀就可以完成多元梯度洗脱操作,成本大大降低,度洗脱操作,成本大大降低,所以比高压梯度装置的适用性所以比高压梯度装置的适用性强。强。2 2、与高压梯度相比,在流动相、与高压梯度相比,在流动相被加压输入到色谱柱前,不同被加压输入到色谱柱前,不同组分溶剂混合产生的体积变化组分溶剂混合产生的体积变化已完成,可避
13、免高压梯度流动已完成,可避免高压梯度流动相体积变化引起的流量变化。相体积变化引起的流量变化。1 1、采用低压梯度装置时,各流采用低压梯度装置时,各流动相组分混合前需要严格进行脱动相组分混合前需要严格进行脱气,否则混合过程易产生气泡,气,否则混合过程易产生气泡,如加配在线脱气装置可很好解决如加配在线脱气装置可很好解决此问题。此问题。2 2、低压梯度装置同样要求泵和混、低压梯度装置同样要求泵和混合室的死体积尽量小,使梯度变合室的死体积尽量小,使梯度变化更接近于连续变化(低压梯度化更接近于连续变化(低压梯度变化呈台阶式,当每一个台阶很变化呈台阶式,当每一个台阶很小时,可接近连续变化)。小时,可接近连
14、续变化)。缺点液相色谱的关键技术液相色谱的关键技术高压输液泵高压输液泵恒流泵恒流泵恒压泵恒压泵注射型泵注射型泵往复型泵往复型泵双泵头往复双泵头往复式柱塞泵式柱塞泵双柱塞往复双柱塞往复式串联泵式串联泵液相色谱发展的瓶颈-泵是关键泵体材料耐腐蚀泵体材料耐腐蚀泵腔的体积要泵腔的体积要小,以便快小,以便快速更换溶剂速更换溶剂能在高压下连续能在高压下连续工作工作,耐压耐压40-40-50MPa.cm50MPa.cm2 2压力平稳,无压力平稳,无脉冲脉冲高压输液泵高压输液泵输出流量稳定,输出流量稳定,重复性高重复性高,输出输出流量范围宽流量范围宽液相色谱发展的瓶颈-泵是关键液相色谱发展的瓶颈-泵是关键单柱
15、塞泵单柱塞泵双柱塞串联往复泵结构双柱塞串联往复泵结构RR实施压力控制区域高速反馈、实时控制的流量控制技术 系统系统系统系统采用一个高速采用一个高速采用一个高速采用一个高速CPUCPU对内部压力进行实时对内部压力进行实时对内部压力进行实时对内部压力进行实时监控,在柱塞换向的时间区段内,系统压力有下监控,在柱塞换向的时间区段内,系统压力有下监控,在柱塞换向的时间区段内,系统压力有下监控,在柱塞换向的时间区段内,系统压力有下降趋势时快速反馈给降趋势时快速反馈给降趋势时快速反馈给降趋势时快速反馈给CPUCPU,并发出指令使电机加,并发出指令使电机加,并发出指令使电机加,并发出指令使电机加速运转,消除脉
16、动。反之,当系统压力升高时,速运转,消除脉动。反之,当系统压力升高时,速运转,消除脉动。反之,当系统压力升高时,速运转,消除脉动。反之,当系统压力升高时,则电机减慢运转。则电机减慢运转。则电机减慢运转。则电机减慢运转。采用这种技术,可实时补偿溶剂压缩率和单采用这种技术,可实时补偿溶剂压缩率和单采用这种技术,可实时补偿溶剂压缩率和单采用这种技术,可实时补偿溶剂压缩率和单向阀换向时的泄漏引起的压力波动。系统中无须向阀换向时的泄漏引起的压力波动。系统中无须向阀换向时的泄漏引起的压力波动。系统中无须向阀换向时的泄漏引起的压力波动。系统中无须任何缓冲装置,也可以稳定输液。任何缓冲装置,也可以稳定输液。任
17、何缓冲装置,也可以稳定输液。任何缓冲装置,也可以稳定输液。日立传统的日立传统的日立传统的日立传统的HPLCHPLC泵就是采用这种设计,而泵就是采用这种设计,而泵就是采用这种设计,而泵就是采用这种设计,而在在在在L-2000L-2000系列的泵中,这种实时控制方法在较早系列的泵中,这种实时控制方法在较早系列的泵中,这种实时控制方法在较早系列的泵中,这种实时控制方法在较早的时间段就开始执行,以便进一步降低波动。的时间段就开始执行,以便进一步降低波动。的时间段就开始执行,以便进一步降低波动。的时间段就开始执行,以便进一步降低波动。LC2000输液泵采用日立特有输液泵采用日立特有“泵前合流、泵泵前合流
18、、泵后直接混合后直接混合”技术,克服传统概念上低压梯技术,克服传统概念上低压梯度(比例阀梯度)稳定性差的问题。日立比度(比例阀梯度)稳定性差的问题。日立比例阀梯度系统由于是在泵后高压部分进行混例阀梯度系统由于是在泵后高压部分进行混合,不容易产生气泡,稳定性与多泵梯度合,不容易产生气泡,稳定性与多泵梯度(高压梯度或直接混合梯度)相同,同时又(高压梯度或直接混合梯度)相同,同时又具有极高的梯度精度具有极高的梯度精度。泵前合流、泵后直接的比例阀梯度混合技术LC2000液相色谱简介液相色谱简介-LC2130泵泵比例阀、混合器比例阀、混合器泵泵进样阀进样阀检测器检测器低压区低压区低压区低压区 高压区高压
19、区高压区高压区传统低压梯度传统低压梯度传统低压梯度传统低压梯度混合方式混合方式混合方式混合方式 由于在泵前低压状态下进由于在泵前低压状态下进由于在泵前低压状态下进由于在泵前低压状态下进行梯度混合,容易产生气泡,行梯度混合,容易产生气泡,行梯度混合,容易产生气泡,行梯度混合,容易产生气泡,气泡易累积在输液泵中,引起气泡易累积在输液泵中,引起气泡易累积在输液泵中,引起气泡易累积在输液泵中,引起泵输液不稳;同时混合精密度泵输液不稳;同时混合精密度泵输液不稳;同时混合精密度泵输液不稳;同时混合精密度低。低。低。低。泵头泵头比例阀比例阀流通池流通池色谱柱色谱柱混合器混合器进样阀进样阀流动相流动相废液阀废
20、液阀日立最新比例阀梯度混合系统泵后高压状态下混合:不易产生气泡泵后高压状态下混合:不易产生气泡 混合精密度高!混合精密度高!LC2000液相色谱简介液相色谱简介-LC2130泵泵紫外检测器的工作原理紫外检测器的工作原理可变波长的紫外吸收检测器可变波长的紫外吸收检测器LC2000液相色谱简介液相色谱简介 -LC2030检测器检测器比例双光路设计丰富的程序功能符合 GLP/GMP 要求关键元件进口LC2000液相色谱简介液相色谱简介 -LC2030检测器检测器LC2030监测器光路示意图三三 比例双光路设计比例双光路设计 LC2030检测器采用检测器采用双光路设计,可以克双光路设计,可以克服用于电
21、路、光源等服用于电路、光源等的漂移产生的检测器的漂移产生的检测器输出信号变化,提高输出信号变化,提高了仪器的稳定性和样了仪器的稳定性和样品检测能力。品检测能力。LC2000液相色谱简介液相色谱简介 -LC2030检测器检测器四四 功能强大功能强大波长扫描波长扫描 摸索未知组分的检测条件(寻找合摸索未知组分的检测条件(寻找合摸索未知组分的检测条件(寻找合摸索未知组分的检测条件(寻找合 适的检测波长)适的检测波长)适的检测波长)适的检测波长)波长时间程序波长时间程序 为样品中含有不同灵敏响应波长的为样品中含有不同灵敏响应波长的为样品中含有不同灵敏响应波长的为样品中含有不同灵敏响应波长的 组分都能高
22、灵敏检测提供了可能组分都能高灵敏检测提供了可能组分都能高灵敏检测提供了可能组分都能高灵敏检测提供了可能 谱图谱图/程序存储程序存储 波长时间程序、扫描程序可自动保波长时间程序、扫描程序可自动保波长时间程序、扫描程序可自动保波长时间程序、扫描程序可自动保 存、扫描谱图可保存和输出存、扫描谱图可保存和输出存、扫描谱图可保存和输出存、扫描谱图可保存和输出符合符合GLP/GMP 要求要求要求要求 换灯日期、点灯次数、点灯换灯日期、点灯次数、点灯换灯日期、点灯次数、点灯换灯日期、点灯次数、点灯 总时间等都可被自动记录;对基线总时间等都可被自动记录;对基线总时间等都可被自动记录;对基线总时间等都可被自动记
23、录;对基线 噪音、波长准确度等仪器性能可自噪音、波长准确度等仪器性能可自噪音、波长准确度等仪器性能可自噪音、波长准确度等仪器性能可自 动评价动评价动评价动评价 液相色谱的定性、定量方法液相色谱的定性、定量方法色谱峰定性色谱峰定性n n鉴别每个色谱峰n n通过比较保留值通过比较保留值(通常是保留时间通常是保留时间)的方法,找的方法,找到各色谱峰所对应的组份到各色谱峰所对应的组份n n大多数情况下用比较保留时间来定性大多数情况下用比较保留时间来定性即所谓:保留时间相同,可能是同样的组份保留时间相同,可能是同样的组份保留时间不同,肯定不是同样的组份保留时间不同,肯定不是同样的组份用保留时间定性用保留
24、时间定性n n用“标样”的保留值定出被测组份的位置进一步的确认进一步的确认n n标准加入n n同时用其他方法n n其他色谱方法(改变机理,如:用不同的色谱其他色谱方法(改变机理,如:用不同的色谱柱)柱)n n其他检测器其他检测器n nPDAPDA,光谱图比较、谱库检索,光谱图比较、谱库检索n nMSMS,质谱图解析、谱库检索,质谱图解析、谱库检索n n其他仪器方法其他仪器方法常用的定量方法常用的定量方法n n峰面积百分比法n n由于检测技术的影响,在液相色谱中不常用由于检测技术的影响,在液相色谱中不常用n n外标法n n在液相色谱中用的最多在液相色谱中用的最多n n内标法n n准确,但是麻烦准
25、确,但是麻烦n n在标准方法中用的最多在标准方法中用的最多外标法定量外标法定量n n配制一系列已知浓度的标样外标法定量(二)外标法定量(二)n n实际色谱图标准曲线外标法定量(三)外标法定量(三)n n计算公式n n特点n n无需各组份都被检出、洗脱无需各组份都被检出、洗脱n n需要标样需要标样n n标样及样品测定的条件要一致标样及样品测定的条件要一致n n进样体积要准确进样体积要准确进样技术对定量结果的影响进样技术对定量结果的影响n n固固定定体体积积定定量量管管(looploop)的的进进样样器器精精度度最最好好,其其准确度取决于进样器的结构准确度取决于进样器的结构n n可可变变体体积积进
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