细菌分离与鉴定方.pptx
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1、细菌分离与鉴定方法细菌分离与鉴定方法嗜水气单胞菌分离鉴定嗜水气单胞菌分离鉴定分离方法分离方法细菌的生长状况观察细菌的生长状况观察氧化酶试验氧化酶试验AHM鉴别培养鉴别培养吲哚试验吲哚试验革兰氏染色法革兰氏染色法糖发酵试验糖发酵试验脱脂奶平板试验(酪蛋白胨化试验)脱脂奶平板试验(酪蛋白胨化试验)分离方法分离方法用途用途:在检查含两种或两种以上的待检材料(如肝、脾、肾、在检查含两种或两种以上的待检材料(如肝、脾、肾、心、肌肉等)中的某种细菌时,须先将待检材料进行心、肌肉等)中的某种细菌时,须先将待检材料进行分离培养。常用的分离培养方法是琼脂平皿分区划线分离培养。常用的分离培养方法是琼脂平皿分区划线
2、法,是借划线将混杂的细菌在琼脂平皿表面分散开来,法,是借划线将混杂的细菌在琼脂平皿表面分散开来,使个别的细菌能固定在某一点,经培养生长繁殖后形使个别的细菌能固定在某一点,经培养生长繁殖后形成单个菌落,以达到分离获得纯种细菌的目的。成单个菌落,以达到分离获得纯种细菌的目的。分离方法分离方法具体操作方法如下:具体操作方法如下:点燃酒精灯,右手执笔式握持接种环(见图点燃酒精灯,右手执笔式握持接种环(见图1),在酒精灯火焰上烧灼接种环,),在酒精灯火焰上烧灼接种环,待冷,取待测菌液一环。待冷,取待测菌液一环。左手抓握琼脂培养基平皿,用手掌将平皿的底固定,用手指将平皿的盖略抬左手抓握琼脂培养基平皿,用手
3、掌将平皿的底固定,用手指将平皿的盖略抬起一些,进行接种(见图起一些,进行接种(见图2)。或者,将平皿的盖留在实验台上,尽量直立平)。或者,将平皿的盖留在实验台上,尽量直立平皿靠近酒精灯火焰,右手持接种环在琼脂表面的一端(即皿靠近酒精灯火焰,右手持接种环在琼脂表面的一端(即1区,约占整个平皿区,约占整个平皿的的1/61/5)涂布,划线时,接种环与琼脂表面呈)涂布,划线时,接种环与琼脂表面呈3040的角度轻轻接触,的角度轻轻接触,利用腕力动作,切忌划破琼脂表面。烧灼接种环,待冷后,将接种环通过利用腕力动作,切忌划破琼脂表面。烧灼接种环,待冷后,将接种环通过1区区划线数次,在划线数次,在2区作连续划
4、线,各线条间隔要小,但不能重叠。划满平皿的区作连续划线,各线条间隔要小,但不能重叠。划满平皿的1/51/4区域,划完区域,划完2区不需烧灼接种环,继续通过区不需烧灼接种环,继续通过2区数次,在区数次,在3区作连续划区作连续划线,如此反复至划完整个平皿(如图线,如此反复至划完整个平皿(如图3)。)。图1 接种环的握持方法图2 平皿的握持方法1区4区3区2区图3 划线分离的方法 左:分区 右:培养后的结果分离方法分离方法接种完毕,盖好平皿盖,在平皿底玻璃上用记号接种完毕,盖好平皿盖,在平皿底玻璃上用记号笔注明标本名称、接种时间、接种者等。然后将笔注明标本名称、接种时间、接种者等。然后将平皿的底朝上
5、,放置在平皿的底朝上,放置在37孵箱内孵育孵箱内孵育24h。取出后观察琼脂表面的菌落分布情况(见图取出后观察琼脂表面的菌落分布情况(见图3),),注意观察最后注意观察最后12区内是否分离出单个菌落,并区内是否分离出单个菌落,并观察记录菌落特征(如菌落大小、形状、透明度、观察记录菌落特征(如菌落大小、形状、透明度、色素等情况)。色素等情况)。烂鳃病病原菌平板划线分离:烂鳃病病原菌平板划线分离:取病鱼鳃丝一小块,置于滴有无菌水的载玻片的边缘,10分钟,用接种环蘸水,在胰胨琼脂培养基上划线。肠炎病病原菌划线分离:肠炎病病原菌划线分离:用70%酒精棉球擦拭鱼体,无菌条件下,取病鱼的肝或脾或肾或心于普通
6、营养琼脂基划线分离。赤皮病病原菌划线分离赤皮病病原菌划线分离:用刀片刮除病灶腐烂部分后用接种环挂取病料,在普通营养琼脂培养基上平板划线。28培养24h。细菌的生长状况观察细菌的生长状况观察原理原理细菌于适宜条件下在不同的培养基上生长,其生长状细菌于适宜条件下在不同的培养基上生长,其生长状态不同。不同细菌在同一种培养基中生长,生长特点也态不同。不同细菌在同一种培养基中生长,生长特点也不相同。这些区别称之为培养特征,是鉴别细菌和细菌不相同。这些区别称之为培养特征,是鉴别细菌和细菌分类的依据之一。分类的依据之一。把细菌接种在固体培养基上,在适宜的条件下经过一把细菌接种在固体培养基上,在适宜的条件下经
7、过一定时间的培养,在培养基表面(或内部)形成肉眼可见定时间的培养,在培养基表面(或内部)形成肉眼可见的有一个细菌大量繁殖后而成的集团,称之为菌落。不的有一个细菌大量繁殖后而成的集团,称之为菌落。不同细菌的菌落大小、光浊度、色泽均有其特征。同细菌的菌落大小、光浊度、色泽均有其特征。普通琼脂平板牛肉膏3.0g蛋白胨10.0g氯化氯化钠(NaCL)5.0g磷酸二氢钾(KH2PO4)1.0g琼脂15.0g蒸馏水1000mL混匀,加热溶解,调PH至7.6分装,112kPa高压灭菌15min,冷却至45倾注灭菌平板。直径90cm平皿每皿倾入1520ml培养基,培养基过少,划线分离时细菌的营养较少,菌落生长
8、过小,菌落形态不易观察,培养基也易于干燥,不易在数天内对菌落形态进行观察。含糖培养基灭菌条件115,1015分钟一般培养基灭菌条件121,1520分钟细菌的生长状况观察细菌的生长状况观察在无菌平皿中,倒入溶化后在无菌平皿中,倒入溶化后50普通营养琼脂培养基,每普通营养琼脂培养基,每皿约皿约20毫升,水平静置待凝固。用接种环挑去待分离菌毫升,水平静置待凝固。用接种环挑去待分离菌株分区划线,株分区划线,28培养培养24h。菌落形态观察:菌落形态观察:大小:以毫米计。大小:以毫米计。形状:圆形、不规则形、放射状等。形状:圆形、不规则形、放射状等。表面:光滑、粗糙、圆环状、乳突状等。表面:光滑、粗糙、
9、圆环状、乳突状等。边缘:整齐、波形、锯齿状等。边缘:整齐、波形、锯齿状等。色素:有颜色,颜色,是否可溶等。色素:有颜色,颜色,是否可溶等。透明度:透明、半透明、不透明。透明度:透明、半透明、不透明。嗜水气单胞菌菌落为光滑、微凸、圆整、无色或淡黄嗜水气单胞菌菌落为光滑、微凸、圆整、无色或淡黄色,有特殊芳香气味。色,有特殊芳香气味。氧化酶试验氧化酶试验原理原理氧化酶亦即细胞色素氧化酶,为细胞色素呼吸酶系统氧化酶亦即细胞色素氧化酶,为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶,系由细胞色素的终末呼吸酶,系由细胞色素a和和a3所组成,一般仅存于需所组成,一般仅存于需氧菌和兼性厌氧菌中,它使细菌能利用氧作为氢的最终
10、受体,氧菌和兼性厌氧菌中,它使细菌能利用氧作为氢的最终受体,使分子氧还原为过氧化氢,过氧化氢的积累会有毒性,固本使分子氧还原为过氧化氢,过氧化氢的积累会有毒性,固本试验的阳性菌,不仅需氧而且能产生过氧化氢酶。氧化酶并试验的阳性菌,不仅需氧而且能产生过氧化氢酶。氧化酶并不是直接与试剂起反应,而是先使细胞色素不是直接与试剂起反应,而是先使细胞色素c氧化,然后此氧化,然后此氧化型细胞色素氧化型细胞色素c再使对苯二胺氧化,产生颜色反应,因而再使对苯二胺氧化,产生颜色反应,因而本试验实际也是测定细胞色素本试验实际也是测定细胞色素c是否存在。是否存在。氧化酶试验氧化酶试验试剂试剂1%盐酸二甲基对苯二胺水溶
11、液或盐酸二甲基对苯二胺水溶液或1%二盐酸四甲基对苯二胺水溶二盐酸四甲基对苯二胺水溶液。液。方法方法在干净的培养皿中放一张滤纸,滴上二甲基对本二胺的在干净的培养皿中放一张滤纸,滴上二甲基对本二胺的1%水溶水溶液,仅使滤纸湿润即可,不可过湿。用白金丝接种环(不可用镍液,仅使滤纸湿润即可,不可过湿。用白金丝接种环(不可用镍铬丝)取铬丝)取1824小时的菌苔,涂抹在湿润的滤纸上,在小时的菌苔,涂抹在湿润的滤纸上,在10s内涂内涂抹菌苔现红色者这为阳性,抹菌苔现红色者这为阳性,(四甲基对本二胺呈蓝色四甲基对本二胺呈蓝色),1060s现红色者为延迟反应,现红色者为延迟反应,60s以上现红色者不计,按阴性处
12、理。以上现红色者不计,按阴性处理。嗜水气单胞菌为阳性。嗜水气单胞菌为阳性。氧化酶试验氧化酶试验注意事项注意事项二甲基对本二胺溶液易于氧化,一般于冰箱中储存两周。二甲基对本二胺溶液易于氧化,一般于冰箱中储存两周。如溶液颜色转红褐色,则不宜使用。如溶液颜色转红褐色,则不宜使用。铁、镍等金属可催化二甲基对苯二胺呈红色,故不宜用以铁、镍等金属可催化二甲基对苯二胺呈红色,故不宜用以上材料取菌苔。如无白金丝,可用玻棒或灭菌牙签取菌苔上材料取菌苔。如无白金丝,可用玻棒或灭菌牙签取菌苔涂抹。涂抹。在滤纸上滴加试液已刚刚湿润为宜。如滤纸过湿,妨碍空在滤纸上滴加试液已刚刚湿润为宜。如滤纸过湿,妨碍空气与菌苔接触,
13、延长显色时间,造成假阴性。气与菌苔接触,延长显色时间,造成假阴性。AHM鉴别培养鉴别培养AHM为AeromonasHydrophilaMedium的缩写。用于可疑气单胞菌菌落的鉴定。用于可疑气单胞菌菌落的鉴定。AHM鉴别培养基鉴别培养基成分成分蛋白胨5.0g酵母提取物3.0g胰蛋白胨10.0gL-盐酸鸟氨酸5.0g甘露醇1.0g肌醇10.0g硫代硫酸钠(Na2S2O35H2O)0.4g枸椽酸铁胺0.5g溴甲酚紫0.02g琼脂3.0g蒸馏水1000mL制法制法将各种成分(除溴甲酚紫外)溶化于1升水中,调pH6.7,加入溴甲酚紫,混匀煮沸。分装于13100mm试管,每管5.0ml,于121,灭菌1
14、5分钟。(溴甲酚紫的有效pH范围5.26.8,颜色变化:黄紫)AHM鉴别培养鉴别培养方法方法以接种针挑取可疑菌落,穿刺接种达于管底,置以接种针挑取可疑菌落,穿刺接种达于管底,置352培培养养1824h,如反应不肯定,可继续培养,如反应不肯定,可继续培养1824h。气单胞菌典型反应为培养基管底部为变黄,在接近于试管气单胞菌典型反应为培养基管底部为变黄,在接近于试管顶部有紫色带出现。此表明反因为甘露醇阳性,肌醇阴性,顶部有紫色带出现。此表明反因为甘露醇阳性,肌醇阴性,鸟氨酸脱羧酶阴性(鸟氨酸脱羧产生腐胺,可使培养基由鸟氨酸脱羧酶阴性(鸟氨酸脱羧产生腐胺,可使培养基由酸变碱)。有时仅在试管顶端部有轻
15、微变黑,此表明是因酸变碱)。有时仅在试管顶端部有轻微变黑,此表明是因分解半胱氨酸产生硫化氢所致。沿穿刺线全部呈混浊状,分解半胱氨酸产生硫化氢所致。沿穿刺线全部呈混浊状,表明该菌具有动力。表明该菌具有动力。吲哚试验吲哚试验原理原理细菌分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚细菌分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚(靛基质靛基质),经,经与试剂中的与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用,生成玫瑰吲哚对二甲基氨基苯甲醛作用,生成玫瑰吲哚而呈红色。而呈红色。培养基培养基1%蛋白胨水水溶液:调蛋白胨水水溶液:调pH7.27.6,分装于,分装于1/31/4试管,试管,115蒸汽灭菌蒸汽灭菌30分钟。分钟。Kovacs试剂试剂对
16、二甲基氨基苯甲醛对二甲基氨基苯甲醛5.0g戊醇戊醇75g(ml)浓盐酸浓盐酸25ml吲哚试验吲哚试验方法方法将新鲜的菌种接种与上述培养基中,将新鲜的菌种接种与上述培养基中,28培养培养24h。沿管壁缓缓加入沿管壁缓缓加入35mm高的高的Kovacs试剂于培养液试剂于培养液表面,在液层界面发生红色,即为阳性反应。若颜色表面,在液层界面发生红色,即为阳性反应。若颜色不明显,可加不明显,可加45滴乙醚至培养基,摇动,使乙醚滴乙醚至培养基,摇动,使乙醚分散于液体中,将培养液静置片刻,待乙醚浮至液面分散于液体中,将培养液静置片刻,待乙醚浮至液面后,在加吲哚试剂。如培养液中有吲哚时,吲哚可被后,在加吲哚试
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