细菌原生质体育种技术及其应用进展.pptx
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1、细菌原生质体育种技术细菌原生质体育种技术及其应用进展及其应用进展报告人:雷用东目目 录录一、前言一、前言一、前言一、前言二、研究现状二、研究现状二、研究现状二、研究现状三、细菌原生质体融合育种原理三、细菌原生质体融合育种原理三、细菌原生质体融合育种原理三、细菌原生质体融合育种原理四、实验过程四、实验过程四、实验过程四、实验过程五、五、五、五、影响细菌原生质体融合的因素影响细菌原生质体融合的因素影响细菌原生质体融合的因素影响细菌原生质体融合的因素 六、六、六、六、应用进展应用进展应用进展应用进展 七、意义及展望七、意义及展望七、意义及展望七、意义及展望一、前言原原生生质质体体育育种种技技术术主主
2、要要有有原原生生质质体体融融合合、原原生生质质体转化技术,此外尚有原生质体诱变育种等。体转化技术,此外尚有原生质体诱变育种等。原生质休融合育种是原生质休融合育种是基因重组基因重组的一种重要方法。的一种重要方法。原原生生质质体体融融合合作作为为一一种种新新的的基基因因重重组组手手段段是是19781978年年第第三三届届国国际际工工业业微微生生物物遗遗传传学学讨讨论论会会上上提提出出来来的。的。一、前言原生质体融合育种技术是原生质体融合育种技术是细菌遗传育种细菌遗传育种的有的有效方法之一,发展迅速,应用广泛。文中综述了效方法之一,发展迅速,应用广泛。文中综述了亲本菌株选择性遗传标记方法、影响原生质
3、体制亲本菌株选择性遗传标记方法、影响原生质体制备与再生因素、原生质体融合方法和条件。介绍备与再生因素、原生质体融合方法和条件。介绍了细菌原生质体融合技术在遗传育种中的应用,了细菌原生质体融合技术在遗传育种中的应用,并展望了细菌原生质体融合技术的发展前景。并展望了细菌原生质体融合技术的发展前景。二、研究现状细菌原生质体融合是细菌原生质体融合是2020世纪世纪7070年代发展起来年代发展起来的重要的重要基因重组基因重组技术。技术。19761976年年FODORKFODORK等采用等采用聚乙聚乙二醇二醇(PEGPEG)、)、磷酸钙磷酸钙诱导巨大诱导巨大芽孢杆菌芽孢杆菌原生质体原生质体的融合,的融合,
4、SCHAEFFEPSCHAEFFEP等报道了用等报道了用PEGPEG诱导诱导枯草芽孢枯草芽孢杆菌杆菌的原生质体融合,这的原生质体融合,这2 2项重要研究成果同时发项重要研究成果同时发表在美国科学院院报上,是细菌原生质体融合技表在美国科学院院报上,是细菌原生质体融合技术发展的术发展的里程碑里程碑,经过,经过3030余年的发展,已经成为余年的发展,已经成为细菌遗传育种的一项基本技术。细菌遗传育种的一项基本技术。三、细菌原生质体融合育种原理三、细菌原生质体融合育种原理 (1)(1)克服种属间杂交的克服种属间杂交的“不育性不育性”,可以进行远缘杂交。由于用,可以进行远缘杂交。由于用酶酶解解除去细胞壁,
5、因此,即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物,除去细胞壁,因此,即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物,皆可发生原生质体融合,产生皆可发生原生质体融合,产生重组子重组子。(2)(2)基因重组基因重组频率高,重组类型多。原生质体融合时,由于聚乙二频率高,重组类型多。原生质体融合时,由于聚乙二醇醇(PEG)(PEG)起促融合的作用,使细胞相互聚集,可以提高基因重组率。起促融合的作用,使细胞相互聚集,可以提高基因重组率。原生质体融合后,两个亲株的整套基因组原生质体融合后,两个亲株的整套基因组 (包括细胞核、细胞质包括细胞核、细胞质)相相互接触,发生多位点的交换,从而产生各种各样的基因组合,获得多
6、互接触,发生多位点的交换,从而产生各种各样的基因组合,获得多种类型的重组子。种类型的重组子。(3)(3)可将由其他育种方法获得的优良性状,经原生质体融合而组合可将由其他育种方法获得的优良性状,经原生质体融合而组合到一个菌株中。到一个菌株中。(4)(4)存在着两个以上亲株同时参与融合,可形成多种性状的存在着两个以上亲株同时参与融合,可形成多种性状的融合子融合子。四、实验过程(一)实验材料:(一)实验材料:1、菌种:枯草芽孢杆菌T4412、枯草芽孢杆菌TT2四、实验过程(一)实验材料:(一)实验材料:(一)实验材料:(一)实验材料:2 2、培养基培养基(1)(1)完全培养基完全培养基(CM(CM,
7、液体,液体);(2)(2)完全培养基完全培养基(CM(CM,固体,固体)液体培养基中加入液体培养基中加入2.0%2.0%琼脂;琼脂;(3)(3)基本培养基基本培养基(MM)(MM);(4)(4)补充基本培养基补充基本培养基(SM)(SM)在基本培养基中加入在基本培养基中加入20g/mL20g/mL的腺嘌呤及的腺嘌呤及2 2的的纯化琼脂,纯化琼脂,75Pa75Pa灭菌灭菌20min20min;(5)(5)再生补充基本培养基再生补充基本培养基(SMR)(SMR)在补充基本培养基中加入在补充基本培养基中加入0.5mol/L0.5mol/L蔗糖,蔗糖,1.01.0纯化琼脂作上层平板,纯化琼脂作上层平板
8、,2.02.0纯化琼脂作底层平板、纯化琼脂作底层平板、75Pa75Pa灭菌灭菌2020minmin。(6)(6)酪蛋白培养基酪蛋白培养基(测蛋白酶活性用测蛋白酶活性用)。四、实验过程(一)实验材料:(一)实验材料:5 5、促融合剂促融合剂促融合剂促融合剂 4040聚乙二醇聚乙二醇(PEG-4000)(PEG-4000)的的SMMSMM溶液。溶液。6 6、溶菌酶液溶菌酶液溶菌酶液溶菌酶液 酶粉酶活为酶粉酶活为4000u/g4000u/g,用,用SMMSMM溶液配制,终浓度为溶液配制,终浓度为2 2mg/mLmg/mL,过滤除菌备用。,过滤除菌备用。7 7、器皿、器皿、器皿、器皿 养皿、移液管、试
9、管、容量瓶、锥形瓶、烧杯、离心管、养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、烧杯、离心管、吸管、显微镜、台式离心机、吸管、显微镜、台式离心机、721721比色计、细菌过滤器。比色计、细菌过滤器。四、实验过程(一)实验材料:(一)实验材料:3 3、缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 (1)0.1mol/LpH6.0(1)0.1mol/LpH6.0磷酸缓冲液。磷酸缓冲液。(2)(2)高渗缓冲液:于上述缓冲液中加入高渗缓冲液:于上述缓冲液中加入0.8mol/L0.8mol/L甘露醇。甘露醇。4 4、原生质体稳定液原生质体稳定液原生质体稳定液原生质体稳定液(SMM)(SMM)0.5mol/L0.5mol/L蔗糖、蔗糖
10、、20mol/LMgC120mol/LMgC1、0.02mol/L0.02mol/L顺丁烯二顺丁烯二酸,调酸,调pH6.5pH6.5。四、实验过程(二)原生质体融合育种流程:(二)原生质体融合育种流程:检出融合子检出融合子检出融合子检出融合子制备制备制备制备原生原生原生原生质体质体质体质体促融合促融合促融合促融合高高渗渗选择选择选择选择亲本亲本亲本亲本化学融合、电融合反复原生原生原生原生质体质体质体质体再生再生再生再生遗传遗传标记、标记、选择选择性培性培养基养基融合子融合子融合子融合子筛选筛选筛选筛选破壁破壁破壁破壁四、实验过程(三)实验过程(三)实验过程1、选择亲本选择亲本选择两个具有育种价
11、值育种价值并带有选择性选择性遗传标记遗传标记的菌株作为亲本。2 2、原生质体的制备、原生质体的制备、原生质体的制备、原生质体的制备(1 1)培养枯草芽孢杆菌)培养枯草芽孢杆菌取亲本菌株取亲本菌株T4412T4412、TT2TT2新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基养基(CM)(CM)的试管中,的试管中,3636振荡培养振荡培养14h14h,各取,各取1mL1mL菌液转接入装有菌液转接入装有20mL20mL液体完全培养基的液体完全培养基的250mL250mL锥形瓶中,锥形瓶中,3636振荡培养振荡培养 3h3h,使细,使细胞生长进入对数前期,各加入胞生长进入对
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