细菌内毒素检查法讲义新乡市食品药品药品检验所.pptx
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1、l简况简况l历史回顾与发展趋势历史回顾与发展趋势l细菌内毒素细菌内毒素l鲎试剂检测内毒素的机理鲎试剂检测内毒素的机理 l20102010年版药典细菌内毒素检查法介绍年版药典细菌内毒素检查法介绍一、简况一、简况 一一百百多多年年前前,在在西西方方医医学学发发展展史史上上,一一个个最最重重要要的的发发展展就就是是注注射射给给药药(特特别别是是静静脉脉注注射射)方方式式的的创创立立。毫毫无无疑疑问问它它在在人人类类与与疾疾病病作作斗斗争争的的过过程程中中起起了了重重要要作作用用,但但是是无无论论过过去去还还是是现现在在,临临床床上上使使用用注注射射剂剂时时经经常常出出现现注注射射引引起起的的发发热热
2、、头头痛痛、恶恶心心、肤肤色色灰灰白白、昏昏迷迷等等,甚甚至至导导致致患患者者死死亡亡,这这些些反反应应总总称称为为不不良良反反应应。不不良良反反应应可可分分为为热热原原反反应应和和过过敏敏反反应应。因因此此,注注射射剂剂的的热热原原检检查查是是保保证证药药品品安安全全的的重重要要检检验验项项目之一。目之一。1912 1912年第一次考虑用家兔做热原试验,年第一次考虑用家兔做热原试验,19421942年美国首先将家兔热原检查方法收入药年美国首先将家兔热原检查方法收入药典。中国药典于典。中国药典于19531953年开始收载。因此,半年开始收载。因此,半个世纪以来,家兔法对保证药品临床使用的安个世
3、纪以来,家兔法对保证药品临床使用的安全发挥了重要的作用。但是,随着科学技术和全发挥了重要的作用。但是,随着科学技术和制药工业的发展,这一检查法的制药工业的发展,这一检查法的局限性局限性越来越越来越明显,所以用新的检验方法代替家兔法检测热明显,所以用新的检验方法代替家兔法检测热原早已成为国内外医药界科研、生产、临床检原早已成为国内外医药界科研、生产、临床检验等部门很紧迫的问题,基于科学实践发展的验等部门很紧迫的问题,基于科学实践发展的要求从而发现并建立了细菌内毒素检查方法。要求从而发现并建立了细菌内毒素检查方法。细菌内毒素试验方法有:细菌内毒素试验方法有:凝胶法(凝胶法(Gelation ass
4、ayGelation assay)属限量;属限量;浊度法(浊度法(Turbidimetrec assayTurbidimetrec assay)属定量;属定量;显色底物法(显色底物法(Chromogenic assayChromogenic assay)属定量法;属定量法;免疫方法(免疫方法(Immumology assayImmumology assay)等。等。历史回顾和发展趋势历史回顾和发展趋势1、历史回顾历史回顾 美国是发明鲎试剂和最先建立鲎试验方法的国家。美国是发明鲎试剂和最先建立鲎试验方法的国家。19561956年年,美美国国动动物物学学家家F.BangF.Bang发发表表论论文文
5、鲎鲎的的一一种种细菌性疾病,阐述了细菌内毒素使鲎血凝固的现象。细菌性疾病,阐述了细菌内毒素使鲎血凝固的现象。19641964年年,F.BangF.Bang和和J.levinJ.levin提提出出了了鲎鲎血血凝凝集集的的初初步步机机理。理。1968 1968年,年,F.BangF.Bang和和J.levinJ.levin建立了鲎试验的方法。建立了鲎试验的方法。19731973年年,美美国国食食品品药药物物管管理理局局(FDAFDA)承承认认鲎鲎试试剂剂为一种生物制品。为一种生物制品。19801980年年,FDAFDA制制定定了了用用鲎鲎试试剂剂检检查查人人用用和和兽兽用用注注射射药药内内毒毒素素
6、的的准准则则;美美国国药药典典2020版版(USPXXUSPXX)收收载载细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法(BETBET),但在药典各品种正文中未涉及。但在药典各品种正文中未涉及。19831983年年,USPXXUSPXX版版第第四四增增补补本本规规定定了了注注射射用用水水等等5 5种种常常用用药药品品和和4040种种放放射射性性药药品品用用细细菌菌内毒素检查取代热原检查。内毒素检查取代热原检查。19911991年年,USPXXUSPXX版版第第五五增增补补本本规规定定185185种药品以细菌内毒素检查取代热原检查。种药品以细菌内毒素检查取代热原检查。19951995年年,USPXXUSPXX
7、版版规规定定471471种种药药品品用用细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法检检查查,保保留留热热原原检检查查的的药药品品不足不足3030种。种。19991999年年,USPXXUSPXX版版规规定定670670种种药药品品用用细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法检检查查,保保留留热热原原检检查查的的药药品品约约2020种。种。20002000年年,国国际际调调和和委委员员会会使使美美国国药药典典(USPUSP)、欧欧洲洲药药典典(EPEP)和和日日本本药药局局方方(JPJP)达达成成BETBET的的国国际际调调和和案案,统统一一的的BETBET已已收收载载于于USPXXUSPXX和和NF19NF19
8、的的第第二二增增补补本中,并于本中,并于20012001年年1 1月月1 1日生效。日生效。英英国国、欧欧洲洲药药典典以以及及日日本本药药局局方方都都已已收收载载细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法,但但规规定定检检查查的的品品种种各各有有不不同同。一一个个共共同同的的特特点点是是注注射射水水是是最最先先被被允允许许检检查查的的品种。品种。中中国国目目前前是是世世界界上上鲎鲎试试剂剂产产量量最最大大的的国国家家之之一。一。1975 197519821982年是我国鲎试剂的研制阶段,年是我国鲎试剂的研制阶段,当时由于缺乏标准化研究的基础,上千批次的当时由于缺乏标准化研究的基础,上千批次的实验结果难于
9、分析。实验结果难于分析。19831983年,卫生部授权国家药品生物制品检年,卫生部授权国家药品生物制品检定所组织全国范围的大输液及放射性药品鲎试验定所组织全国范围的大输液及放射性药品鲎试验的协作研究。的协作研究。19881988年年,卫卫生生部部颁颁布布细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法,允允许许4 4种药品使用细菌内毒素检查法初检。种药品使用细菌内毒素检查法初检。19931993年年,中中国国药药典典19901990年年版版第第二二增增补补本本收收载载细菌内毒素检查法,但未涉及任何品种正文。细菌内毒素检查法,但未涉及任何品种正文。19951995年年,“中中国国药药典典细细菌菌内内毒毒素素检检
10、查查法法实实施施会会议议纪纪要要”提提出出争争取取在在3 35 5内内我我国国上上百百种种药药品品由热原检查法改为细菌内毒素检查法。由热原检查法改为细菌内毒素检查法。19961996年年,中中国国药药典典19951995年年版版二二部部附附录录收收载载经经修修订订的的细细菌菌内内的的毒毒素素检检查查法法,注注射射用用水水等等五五种种常常用用药药品品和和九九种种放放射射性性药药品品正正文文规规定定了了细细菌菌内内毒毒素素检检查查,取取消消了了热热原原检检查查(其其中中5%5%及及10%10%葡葡萄萄糖糖注注射液是后来发通知补充)。射液是后来发通知补充)。19981998年年,中中国国药药典典19
11、951995年年版版19981998年年增增补补本本收收载载经经重重大大修修订订的的细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法,其其中中对对鲎鲎试试剂剂和和细细菌菌内内毒毒素素检检查查用用水水的的质质量量以以及及细细菌菌内内毒毒素素检查方法提出了更高要求。检查方法提出了更高要求。20002000年年,中中国国药药典典20002000年年版版(二二部部)新新增增细细菌菌内内毒毒素素检检查查品品种种5757种种,且且收收载载了了细菌内毒素检查法应用指导原则。细菌内毒素检查法应用指导原则。2002005 5年,中国药典年,中国药典2002005 5年版(二部)年版(二部)新增细菌内毒素检查品种约新增细菌内毒素
12、检查品种约200200种。种。2 2、发展趋势、发展趋势 A.A.各国药典收载细菌内毒素检查法成为发展的趋势各国药典收载细菌内毒素检查法成为发展的趋势 细菌内毒素检查法作为一种新技术载入药典,成细菌内毒素检查法作为一种新技术载入药典,成为官方承认的一种法定的药检方法,反映了药典标为官方承认的一种法定的药检方法,反映了药典标准水平、药检技术水平的提高,标志着一个国家制准水平、药检技术水平的提高,标志着一个国家制药工业水平及药品质量的提高。随着时间的推移,药工业水平及药品质量的提高。随着时间的推移,必将有更多国家的药典收载细菌内毒素检查法。必将有更多国家的药典收载细菌内毒素检查法。B.细菌内毒素检
13、查取代热原检查成为必然的趋势细菌内毒素检查取代热原检查成为必然的趋势 细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法所所具具有有的的优优点点表表明明它它比比热热原原检检查查法法更更适适应应现现代代制制药药工工业业的的发发展展。从从USPXXUSPXX版版开开始始收收载载细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法,到到USPXXUSPXX版版已已有有超超过过90%90%的的注注射射剂剂品品种种规规定定内内毒毒素素检检查查。其其它它国国家家的的药药典典规规定定细细菌菌内内毒毒素素检检查查的的品品种种同同样样经经历历了了从从无无到到有有,从从少少到到多多的的过过程程。可可以以预预见见,细细菌菌内内毒毒素素检检查查最最终终必
14、必然然会会取取代代绝绝大大多多数数注注射射剂剂品品种的热原检查。种的热原检查。C.C.走向统一的细菌内毒素检查法走向统一的细菌内毒素检查法 USPUSP、EPEP和和JPJP是是三三个个收收载载细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法(BETBET)较较早早的的药药典典,它它们们分分别别建建立立了了各各自自的的内内毒毒素素标标准准物物和和BETBET,WHOWHO为为了了保保持持内内毒毒素素的的国国际际标标准准品品(ISIS)的的效效价价(IUIU)与与各各国国内内毒毒素素标标准准品品的的效效价价(EUEU)的的一一致致性性,进进行行了了内内毒毒素素ISIS国国际际协协作作研研究究,自自此此,内内毒毒
15、素素的的标标准准在在IUIU与与EUEU之之间间实实现现了了统统一一,即即1 1IU=1EUIU=1EU。虽虽然然内内毒毒素素标标准准初初步步实实行行了了统统一一,但但在在不不同同的的药药典典方方法法下下测测定的内毒素值仍有差别。定的内毒素值仍有差别。细菌内毒素细菌内毒素 细菌内毒素是细菌内毒素是细菌毒素细菌毒素的一类,的一类,是革兰氏阴性菌细是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖(胞壁上的一种脂多糖(Lipoply Saccharide)和微量蛋白)和微量蛋白(Protein)的复合物,它不是细菌或细菌的代谢产物,而)的复合物,它不是细菌或细菌的代谢产物,而是细菌死亡并解体后才释放出来的一种具有
16、内毒素生物活是细菌死亡并解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌(如大肠性的物质。其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌(如大肠杆菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等)及杆菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等)及其它微生物(如衣原体、立克次氏体、螺旋体等)的细胞其它微生物(如衣原体、立克次氏体、螺旋体等)的细胞壁中,其化学成份主要是由壁中,其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。三部分组成。l类脂A可从O-特异链及核心多糖分离出来,游离的类脂A可自身凝聚成大分子的复合体而难溶于水,并具有生物活性。所以
17、,类脂A(Lipida)是内毒素多种生物活性或毒性反应的主要基团。该基团没有种属特异性,所以各属细菌的类脂A结构相似,其毒性反应相似。如发热、血液流动力学改变、弥漫性血管内凝血,并导致休克等。由于类脂A是由4条主链和2条支链的脂肪酸与内酰胺连接组成,所以提纯的内毒素是极为不稳定的。这就要求内毒素应在低温条件下保存,在工作中内毒素稀释应尽可能地缩短时间,并要现配现用。l内毒素具有多种生物活性:内毒素具有多种生物活性:l1 1生物活性:它具有致热性、致死性毒性、生物活性:它具有致热性、致死性毒性、白细胞减少、降低血压,休克、激活凝血系白细胞减少、降低血压,休克、激活凝血系统、诱导机体对内毒素的耐受
18、性、鲎细胞溶统、诱导机体对内毒素的耐受性、鲎细胞溶解物的凝集、刺激淋巴细胞有丝分裂、诱导解物的凝集、刺激淋巴细胞有丝分裂、诱导抗感染的非特异抵抗力、肿瘤细胞坏死作用抗感染的非特异抵抗力、肿瘤细胞坏死作用等一系列生物活性。等一系列生物活性。l2 2耐热性:细菌内毒素具有很强的耐热性,耐热性:细菌内毒素具有很强的耐热性,一般的高压灭菌不能使其灭活,需一般的高压灭菌不能使其灭活,需2503025030分分钟以上的干热灭菌才能使其灭活,目前我国药钟以上的干热灭菌才能使其灭活,目前我国药典热原检查法和细菌内毒素检查法中关于玻璃典热原检查法和细菌内毒素检查法中关于玻璃用具的灭菌处理为用具的灭菌处理为250
19、3025030分钟以上,而日本分钟以上,而日本药局方采用药局方采用25012501小时以上。小时以上。l其它各国药典也大多如此,国内细菌内毒素标其它各国药典也大多如此,国内细菌内毒素标准品的耐热情况虽然未能考察,但可以认为对准品的耐热情况虽然未能考察,但可以认为对细菌内毒素检查法中玻璃用具等的除菌最好采细菌内毒素检查法中玻璃用具等的除菌最好采用用250 30250 30分钟以上的干烤处理。分钟以上的干烤处理。3 3外界因素影响:细菌内毒素的生物活性外界因素影响:细菌内毒素的生物活性随外界因素的影响变化很大。目前已经知随外界因素的影响变化很大。目前已经知道,一些金属离子、超声波以及温度等都道,一
20、些金属离子、超声波以及温度等都会对细菌内毒素的生物活性产生很大影响,会对细菌内毒素的生物活性产生很大影响,据国外文献报导,据国外文献报导,铁离子铁离子、铝离子等会引、铝离子等会引起细菌内毒素活性的降低。起细菌内毒素活性的降低。因此在试验过程中最好使用玻璃用具,因此在试验过程中最好使用玻璃用具,以避免这些因素,另外温度的高低对细菌以避免这些因素,另外温度的高低对细菌内毒素水溶液活性影响很大,根据国内外内毒素水溶液活性影响很大,根据国内外文献报道:内毒素水溶液活性随着环境温文献报道:内毒素水溶液活性随着环境温度的升高而降低,因此对于内毒素水溶液度的升高而降低,因此对于内毒素水溶液一定要在低温处保存
21、,而且对已经稀释好一定要在低温处保存,而且对已经稀释好的内毒素水溶液,要尽可能的在的内毒素水溶液,要尽可能的在2 2小时内用小时内用完,以避免活性降低。完,以避免活性降低。鲎试剂检测内毒素的机理鲎试剂检测内毒素的机理l 1956 1956年,年,BangBang发现细菌中提取的粗发现细菌中提取的粗制品能使鲎因血细胞凝集而死亡,而肺制品能使鲎因血细胞凝集而死亡,而肺炎球菌、葡萄球菌、链球菌的提取物与炎球菌、葡萄球菌、链球菌的提取物与鲎血细胞无凝集反应。鲎血细胞无凝集反应。LevinLevin进一步从鲎进一步从鲎血变形细胞中提取了几种成分并与提纯血变形细胞中提取了几种成分并与提纯的内毒素进行凝集实
22、验的研究,并提出的内毒素进行凝集实验的研究,并提出了内毒素的凝胶试验法。了内毒素的凝胶试验法。l鲎的种属及分布l鲎,又称作王蟹,是一种栖生于海洋中的低等无脊椎动物,大约出现在古生代泥盆纪,距今已明几亿年的历史,但直到现在它的形态并无重大变化故有“活化石”之称,鲎是从古生代的三叶虫演化而来。l鲎的种属很少,目前全世界仅存三属4种:l1.美洲鲎LimuluspolyphemusLinnaEUs分布在北美西太平洋沿岸l2.东方鲎TachyplEUstridentatusLeach分布在中国、日本、菲律宾等l3.巨鲎TachyplEUsgigasMuller分布在泰国、印度尼西亚等4.园尾鲎Carci
23、noscorpiusrotundicaudapocock分布马来半岛、印尼等l其中能够用于制备鲎试剂的主要有:1.美洲鲎和2.东方鲎。l鲎血呈天蓝色,是由于存在能携氧的含鲎血呈天蓝色,是由于存在能携氧的含铜血蓝蛋白铜血蓝蛋白(hemocyaninhemocyanin)所致。鲎)所致。鲎血中仅有一种白细胞,又称血中仅有一种白细胞,又称变形细胞变形细胞,它含有高密度的颗粒,颗粒中含有与内它含有高密度的颗粒,颗粒中含有与内毒素起凝集作用的酶系统,即凝固蛋白毒素起凝集作用的酶系统,即凝固蛋白原(原(CoagulogenCoagulogen)凝固酶原)凝固酶原(proclotting enzymepro
24、clotting enzyme),),B B因子因子(factor Bfactor B)和)和C C因子(因子(factor Cfactor C)等。)等。l内毒素可使内毒素可使C C因子激活,激活的因子激活,激活的C C因子可使因子可使B B因子激活,激活因子激活,激活B B因子又可使凝固酶原活因子又可使凝固酶原活化成凝固酶,后者通过酶解作用使凝固蛋化成凝固酶,后者通过酶解作用使凝固蛋白原转变为凝固蛋白(白原转变为凝固蛋白(coagulincoagulin)。凝固)。凝固蛋白又通过交联(蛋白又通过交联(crosslinking crosslinking enzymeenzyme)作用,相互聚
25、合而形成纤维状的)作用,相互聚合而形成纤维状的凝胶。凝胶。2010年版药典细菌内毒素年版药典细菌内毒素检查法介绍检查法介绍l整体结构整体结构l1.综述部分综述部分检查法的描述试验的准备限值(L)的确定确定最大有效稀释倍数(MVD)l2.实验部分实验部分凝胶法 光度测定法a鲎试剂灵敏度复核a标准曲线的可靠性实验b干扰实验b干扰实验c检查法:限量试验c检查法半定量试验综述部分综述部分1.检查法的描述2.试验的准备3.限值(L)的确定4.确定最大有效稀释倍数(MVD)l本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素,以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。检查法的描述检查法的
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