固相萃取柱原理及应用.pptx

固相萃取柱简介何 群丹东兽药饲料监察所固相萃取原理v固相萃取(SolidPhaseExtraction，简称SPE)，也称固相提取，是一项结合了选择性保留、选择性洗脱等过程的分离技术。v当复杂的样品溶液通过吸附剂(Sorbent)时，吸附剂会通过极性相互作用、疏水相互作用或离子交换等作用力选择性地保留目标物(AimedCompound)和少量与目标物性质相近的组分，其他组分则透过吸附剂流出小柱，然后用另一种溶剂体系选择性地把目标物洗脱下来，从而实现对复杂样品的分离、纯化和富集。v在固相萃取过程中，“保留”(Retention)和“洗脱”(Elution)均受目标物、吸附剂和溶剂三种因素的影响，对于给定的目标物，选择合适的吸附剂、样品溶剂以及洗脱溶剂是实现成功分离的关键。固相萃取的作用v富集：痕量分析或制备时，对目标物进行富集是必要的过程。比如，分析水中的PAHs，可以将1000mL水样加入SPE柱，PAHs保留在柱中，然后用少量溶剂(比如2mL)洗脱，这样PAHs就被浓缩了500倍，这意味着在相同的检测条件下，分析物的方法检测限仅为为处理前的1/500。v净化：在仪器分析之前除去除去杂质，这一方面避免了杂质对目标物的干扰，提高了分析灵敏度，另一方面也避免了杂质对或仪器的损害。v转换溶剂：一些分析仪器对分析物溶解溶剂有特殊的要求，可以通过SPE柱进行转换。比如，采用GC法分析水中的半挥发性污染物时，如果采用直接进样，水分会影响分离并损害气相色谱柱，因而需要转换溶剂。将水样加入反相萃取柱，目标物保留在柱中与水分离，然后用对目标物溶解性强并且易挥发的有机溶剂洗脱，干燥并浓缩后即可分析。SPE柱的结构v柱管：吸附剂的载体，由血清级的聚丙烯制成，通常做成注射器形状。一些厂家也提供玻璃的柱管用以特殊分析(比如PAEs分析)。柱管下端出口的尺寸已标准化，可用于不同厂家的固相萃取多管真空装置。v筛板：起固定吸附剂和过滤溶液的作用。聚乙烯是常见的筛板材料，对于特殊分析也可采用特氟隆、不锈钢片或玻璃等材质。v吸附剂：固相萃取柱中发挥分离作用的物质。早期广泛应用于柱层析的Al2O3、florisil、石墨化炭黑等吸附剂在固相萃取中仍被使用；目前最常见的吸附剂是硅胶键合吸附剂，由球形硅胶颗粒键合各种官能团制得；上世纪末被发明的有机聚合物吸附剂，比如聚二乙烯基苯-N-乙烯吡咯烷酮，以重现性好、pH适用范围宽以及适用性广等优势在许多应用中已经取代硅胶键合吸附剂。v配套装置：储样器，用于增加柱管上方的容器体积，提高单次上样量；适配器，用于连接柱管与柱管、柱管与储样器。固相萃取技术常见术语v吸附剂(Sorbent)：固相萃取柱中的填充物，能够从样品溶液中选择性地萃取某些化合物；v吸附容量(Capacity)：在特定条件下，一定质量吸附剂能够保留化合物(包括目标化合物和部分干扰物)的总质量；固相萃取柱一般使用过程v活化(Activation)：也称溶剂化，加入合适的溶剂使吸附剂上的官能团展开，并除去吸附剂上可能存在的干扰物，对于反相吸附剂常常用中等极性溶剂(比如甲醇)，正相吸附剂常常用弱极性或非极性溶剂(比如己烷)；v平衡(Equilibrium)：除去活化溶剂为上样创造适宜的溶剂环境，所用溶剂通常与样品溶液的溶剂一致；对于离子交换柱，如果样品是碱性化合物平衡液中往往需要加入酸，如果样品为酸性化合物平衡液中往往需要加入碱；v保留(Retention)：当样品溶液通过吸附剂，吸附剂与某些化合物的作用力超过后者与溶剂的作用力时，这些化合物就会被吸附剂固定，该过程称为保留；v淋洗(Washing)：上样后，部分干扰物与目标化合物同时被保留，需要加入合适的溶液以最大可能地除去干扰物而不影响目标化合物的保留，通常情况下用上样时的样品溶剂淋洗不会影响回收率，但洗脱强度较大的溶剂能最大程度地去除干扰物，选择淋洗液时需要在回收率和净化效果间找到平衡点；v洗脱(Elution)：让洗脱能力较强的溶剂通过吸附剂，打断吸附剂与被保留的化合物之间的作用力，使这些化合物随溶剂从吸附剂中流出；通常情况下，能刚好洗脱目标化合物的洗脱溶剂是最佳选择，此时洗掉的干扰物最少，选择洗脱液时也需要在回收率和净化效果间找到平衡点；固相萃取过程中的作用力v非极性相互作用(Non-PolarInteraction)：目标化合物上的非极性官能团与非极性吸附剂之间的作用力，这种作用力在极性溶剂环境尤其是水环境中才能较好体现，因而也称疏水相互作用，比如水环境中，邻苯二甲酸酯类化合物与C18之间的作用力；v极性相互作用(PolarInteraction)：目标化合物上的极性官能团与吸附剂上的极性官能团之间的作用力，这种作用力在弱极性或非极性溶剂环境下才能较好的体现；v离子相互作用(IonInteraction)：离子型目标化合物上的离子官能团与吸附剂上带有相反电荷的官能团之间的库伦力；v次级相互作用(SecondaryInteraction)：对于反相硅胶键合吸附剂，颗粒表面残余的硅羟基会与极性化合物发生极性相互作用，并且部分硅羟基解离后会与碱性化合物发生离子相互作用，相对于非极性相互作用这些作用力处于次要地位，因而被称为次级相互作用。次级相互作用是反相硅胶吸附剂所不期望的，通常可以通过封端技术(Endcaping)加以消除；非极性相互作用(Non-PolarInteraction)v非极性相互作用是指发生在(吸附剂上)烃基和(目标化合物上)烃基之间的作用力，这类基团呈现非极性或弱极性，它们之间仅存在一种名为“色散力”的作用力(属于VanDerWaals力的一种)。由于绝大多数有机化合物分子均含有或多或少的非极性基团，非极性相互作用会使这些化合物保留在含有非极性官能团的吸附剂上。非极性相互作用(Non-PolarInteraction)v未键合的硅胶不显示非极性相互作用，但硅胶基质键合链状官能团后得到的吸附剂会表现出一定程度的非极性，使得硅胶键合相具有非极性相互作用。C18(硅胶键合十八烷基，封端)是真正的非极性吸附剂，它和目标化合物之间仅存在非极性相互作用；C8(硅胶键合辛基)和PH(硅胶键合苯基)的非极性弱于C18，但非极性相互作用仍是这些吸附剂的主要作用力，它们与目标化合物间的其他作用力可以被忽略。C2(硅胶键合乙基)和CN(硅胶键合氰丙基)的碳链更短，同时具备非极性相互作用和极性相互作用，但非极性相互作用仍占优势。键合有极性基团和离子基团的吸附剂(NH2、PSA、SCX、SAX等)具有较强的极性，它们与目标化合物间的非极性相互作用显得微不足道。v对于聚合物基质的吸附剂，比如ProEutPLS、PXC、PXA、PWC、PWA等以聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物为基质的吸附剂，吸附剂中的苯基和乙烯基为非极性基团，非极性相互作用是这些吸附剂与目标化合物间重要作用力。ProElutPXC、PXA、PWC、PWA等与离子型化合物间还存在较强的离子交换作用，是另一重要作用力。非极性相互作用(Non-PolarInteraction)v吸附剂与目标化合物间作用力的强弱受溶剂环境的影响。v强极性溶剂环境可以促进非极性吸附剂和目标化合物之间的非极性相互作用，并且在极性环境下，即使目标化合物含有极性基团，其非极性部分与非极性吸附剂之间也将发生非极性相互作用。因而使用非极性和弱极性吸附剂时，最好的样品溶剂是纯水，因为纯水可以增加非极性相互作用，促进目标化合物保留。v极性较弱的有机溶剂对目标化合物具有一定的溶解性，能够破坏目标化合物和吸附剂之间非极性相互作用，比如甲醇这样的极性溶剂就具有足够的非极性以打断许多弱极性化合物与非极性吸附剂之间的非极性相互作用，将化合物从吸附剂上洗脱下来。对于极性更弱的目标化合物，就需要乙酸乙酯、甲基叔丁基醚甚至正己烷这样的弱或非极性溶剂进行洗脱。非极性相互作用(Non-PolarInteraction)v一般来说，非极性萃取法比极性或离子交换萃取法选择性小，尤其是当目标化合物结构与样品基质组分相似的时候，但非极性相互作用用于分离具有结构具有差异的一组化合物时则很有效。v总之，通过非极性相互作用保留目标化合物时总之，通过非极性相互作用保留目标化合物时(亦即使用反相亦即使用反相固相萃取柱时固相萃取柱时)，极性溶剂，极性溶剂(尤其是水尤其是水)能够增强这类分离物的能够增强这类分离物的保留，可以选作上样时的样品溶剂和淋洗溶剂；弱极性的溶保留，可以选作上样时的样品溶剂和淋洗溶剂；弱极性的溶剂或混合溶剂能够破坏目标化合物与吸附剂间的非极性相互剂或混合溶剂能够破坏目标化合物与吸附剂间的非极性相互作用，将目标化合物从非极性吸附剂上洗脱下来。作用，将目标化合物从非极性吸附剂上洗脱下来。非极性相互作用(Non-PolarInteraction)C18固相萃取柱C8固相萃取柱CH固相萃取柱非极性相互作用(Non-PolarInteraction)PH固相萃取柱PLS固相萃取柱极性相互作用(PolarInteraction)v多种吸附剂与目标化合物官能团之间存在极性相互作用。极性相互作用包括氢键(HydrogenBonding)，偶极距(Dipole/Dipole)，诱导偶极距(InducedDipole/Dipole)，-(Pi-Pi)和其它多种相互作用力。极性基团上往往是一些电负性差异较大的原子，电子云在这些原子间具有不同的密度，使官能团带有极性，这一性质进而使具有极性官能团的目标化合物分子与吸附剂上的极性官能团发生相互作用。典型的极性互相作用基团包括羟基、胺基，羰基、巯基、双键以及带有杂原子(如氧、氮、氟、硫和磷)的基团。极性相互作用(PolarInteraction)v由于硅胶基质(尤其是游离的硅羟基)具有较强的极性，极性相互作用广泛存在于硅胶键合吸附剂中，在非极性溶剂中，硅胶键合吸附剂的次级极性相互作用尤为显著，含胺基和羟基对次级相互作用极为敏感。v键合了非极性基团的非极性吸附剂(C18、C8、PH、CH等)通常被用来保留非极性和弱极性化合物，其硅胶基质表面残余的硅羟基经过了封端处理，并且通常在极性溶剂环境下操作，因而次级相互作用在这些硅胶键合吸附剂中非常微弱；v在极性硅胶键合吸附剂(Silica、NH2、PSA)和离子交换硅胶键合吸附剂(SCX、SAX)中极性相互作用是被期望的，所以无须进行封端处理以抑制次级相互作用。极性相互作用(PolarInteraction)v氢键是最主要极性相互作用力之一。氢键产生的条件为：电负性原子X(氟、氯、氧、氮等)共价结合的氢原子与另一电负性原子Y(氟、氯、氧、氮等)接近，在X与Y之间以氢为媒介，生成X-HY形式的键。羟基或氨基是最主要氢键给予体，能与氢键给予体相互吸引的官能团(亦即氢键受体)是那些包含氧、氮或硫原子的基团极性相互作用(PolarInteraction)v非极性溶剂能促进极性分离物在极性吸附剂上的保留，这是因为非极性溶剂分子无法轻易破坏吸附剂和目标化合物之间的极性相互作用。反之，极性溶剂就能有效地破坏这种极性相互作用，这是因为极性目标化合物易溶于极性溶剂中，并且极性溶剂能更有效地与目标化合物竞争吸附剂上的吸附位点。v高离子浓度同样能够破坏极性相互作用，极性目标化合物经常通过与硅胶基体的次级相互作用保留在非极性吸附剂上，但是这种保留被高离子浓度抑制。如果次级相互作用是需要的，可以让Tris缓冲液通过吸附剂，使该作用力得到加强。极性相互作用(PolarInteraction)v总之，通过非极性相互作用保留目标化合物时，非总之，通过非极性相互作用保留目标化合物时，非极性溶剂极性溶剂(尤其是正己烷尤其是正己烷)能够增强这类分离物的保能够增强这类分离物的保留，可以选作上样时的样品溶剂和淋洗溶剂；极性留，可以选作上样时的样品溶剂和淋洗溶剂；极性和高离子强度的溶剂能够破坏目标化合物与吸附剂和高离子强度的溶剂能够破坏目标化合物与吸附剂间的极性相互作用，将分离物从非极性吸附剂上洗间的极性相互作用，将分离物从非极性吸附剂上洗脱下来。极性的次级相互作用是胺基或羟基类目标脱下来。极性的次级相互作用是胺基或羟基类目标化合物从非极性溶剂萃取进入极性吸附剂的重要因化合物从非极性溶剂萃取进入极性吸附剂的重要因素。素。极性相互作用(PolarInteraction)SI固相萃取柱NH2固相萃取柱CN固相萃取柱离子相互作用（IonInteraction）v离子相互作用力是指发生在带电荷(正或负)的目标化合物与带相反电荷的吸附剂之间的库伦力。v根据目标化合物基团和吸附剂基团所显示离子的特征，离子交换相互作用可以分成两类：能够阳离子化的基团(正电荷)；能够阴离子化的基团(负电荷)。离子相互作用（IonInteraction）v伯胺、仲胺、叔胺、季铵等有机化合物以及钙、钠、镁等无机阳离子均可阳离子化；v磺酸、羧酸、磷酸以及其它类似基团均可阴离子化。v这些基团“能够”成为阳或阴离子，但它们本身并非离子，因为潜在的离子基团解离与否由溶剂环境的pH值决定。v为了使目标化合物通过离子交换机制在吸附剂上有效地保留，必须同时满足以下两个条件：基质/溶剂的pH值必须使目标化合物和吸附剂均带电荷；介质/溶液中与目标化合物电荷相同的竞争离子的浓度要低。离子相互作用（IonInteraction）v当环境pH值等于某种化合物的pKa值时，溶液中的该化合物分子一半带电荷、另一半则不带电荷。关于pKa值，切记以下关系：当pH值低于分子的pKa值时，带阳离子基团的分子数增加；反之，带阳离子基团的分子数减少。当pH值高于分子的pKa值时，带阴离子基团的分子数增加；反之，带阴离子基团的分子数减少。v为了使目标化合物被保留，溶剂/介质的pH值应处于一个合适的数值以便使目标化合物和吸附剂带电荷，具体的做法是，pH值应低于碱性化合物共轭酸的pKa值，并且至少要比碱性化合物共轭酸的pKa值低2个单位，而比酸性化合物的pKa值高2个单位，在此pH下，超过99%目标化合物带电荷，上样时的样品溶液的pH值应满足这一要求。相反，溶剂体系的pH值高于碱性化合物共轭酸的pKa值，或低于酸性样品的pKa值，目标化合物的离子基团将趋于中性，保留会被减弱，洗脱液的pH值满足这一要求则能将离子型的目标化合物洗脱。v在离子交换中，离子强度(IonicStrength)也是很重要的因素。离子浓度可以用来衡量溶剂/介质环境中所有离子的总浓度。由于离子交换遵循竞争机制，溶剂/介质中的其它相同电荷离子会与目标化合物竞争吸附剂上的离子交换位点，对目标化合物的保留造成影响。低的离子强度能增强目标化合物的保留，而高的离子强度则减弱保留。离子相互作用（IonInteraction）v离子交换吸附剂对特定离子基团具有较强的选择性选择性(Selectivity)。这种选择性是由吸附剂的分子性质造成的，在许多情况下被观察到。比如，季铵离子(一种强阴离子交换吸附剂)对柠檬酸根的选择性比醋酸根高250倍。由于这个原因，与柠檬酸盐平衡处理相比，醋酸盐平衡过的季铵型吸附剂对阴离子目标化合物具有更强的保留性。由于同样的原因，对于季铵型吸附剂保留的阴离子目标化合物，柠檬酸盐缓冲液的洗脱能力远强于醋酸盐缓冲液。恰当地使用吸附剂(对相反离子)的选择性将能使离子交换萃取得到极大的改善。离子相互作用（IonInteraction）v由于硅胶基质表面存在未键合的硅羟基，硅羟基可以部分解离出质子形成负电荷，因而所有硅胶键合相均表现出离子次级相互作用(IonicSecondaryInteractions)。在水环境中离子次级相互作用影响显著，而受离子次级作用影响最大的分离物基团为氨基。比如，当水样中的氨基化合物被非极性吸附剂保留时，离子次级相互作用可能也在发挥作用。使用水/有机溶剂（比如甲醇水溶液）混合液进行洗脱时，离子次级相互作用变得更加明显。此时，尽管甲醇浓度足以破坏非极性相互作用，但活跃的次级作用能够抑制胺基化合物的洗脱。此时，必须通过改变pH值(较高的pH值可使碱性化合物呈中性；较低的pH值可使硅羟基呈中性)或在洗脱溶剂中加入竞争物(二乙胺或三乙胺)来破坏次级相互吸附。竞争物能与氨基化合物竞争吸附剂表面的硅羟基，破坏吸附剂对氨基化合物的二次吸附，使氨基化合物被洗脱。离子相互作用（IonInteraction）v常用的硅胶键合反相吸附剂，如C18、C8、PH、CH、C2，填料合成时，已经进行了封端处理，所以这些吸附剂的离子次级相互作用几乎不发挥作用。有时，为了增大对胺基化合物的保留，合成硅胶键合反相吸附剂时会故意不进行封端处理，比如C18-U(U代表Unendcap未封端)。聚合物基质的吸附剂不含有硅羟基，所以也就不存在离子次级相互作用。最常用的离子交换吸附剂为SCX和SAX，其中ProElutSCX为硅胶键合苯磺酸基的的吸附剂，非常适合保留氨基化合物；而ProElutSAX为硅胶键合季铵基团，非常适合保留带有羧基和酚羟基的化合物；ProElutPXC、PXA、PWC、PWA为聚合物基质的离子交换反相吸附剂，兼具离子交换和反相两种保留基质，对化合物具有更优异的净化效果。离子相互作用（IonInteraction）v以下方法可促进离子交换作用，增强目标化合物的保留：以下方法可促进离子交换作用，增强目标化合物的保留：溶剂溶剂/基质的基质的pH值处于目标化合物和吸附剂的值处于目标化合物和吸附剂的pKa值之间值之间;溶剂溶剂/基质中离子强度低基质中离子强度低;用低选择性的相反离子对吸附剂进行平衡。用低选择性的相反离子对吸附剂进行平衡。v以下方法可促进离子交换吸附剂上分离物洗脱：以下方法可促进离子交换吸附剂上分离物洗脱：溶剂溶剂/基质的基质的pH值高碱性化合物共轭酸的值高碱性化合物共轭酸的pKa或低于酸性化合物的或低于酸性化合物的pKa；溶剂溶剂/基质中离子强度高；基质中离子强度高；溶剂溶剂/介质含有高选择性的相反离子。介质含有高选择性的相反离子。v离子次级相互作用对于离子次级相互作用对于极性溶剂中的质子化氨基化合物极性溶剂中的质子化氨基化合物的保留具有重要意义。的保留具有重要意义。v注：相反离子：与吸附剂上的离子基团电荷相反的离子。离子相互作用（IonInteraction）硅胶键合离子交换吸附剂混合型离子交换反相吸附剂硅胶键合吸附剂v以球形硅胶作为基体，在特定条件下让硅胶表面的硅羟基与硅烷化试剂反应，使硅胶表面被指定的化学官能团覆盖，从而得到了ProElut硅胶键合吸附剂，键合官能团的类型决定着硅胶键合吸附剂的吸附特性。v由于空间位阻的影响，硅烷化反应最高仅能覆盖硅胶表面50%的硅羟基，残余的硅羟基会与极性目标化合物(尤其是碱性化合物)发生极性相互作用，这种相互作用是独立于键合官能团以外的作用力，通常被称作“次级相互作用”(SecondaryInteraction)。v在反相吸附剂中，次级相互作用是不被期望的，因为反相吸附剂对目标化合物的保留是通过非极性相互作用实现的，次级相互作用的存在改变了反相吸附剂的保留机制。为了消除反相吸附剂中的次级相互作用，我们使用空间位阻较小的短碳链硅烷化试剂与硅胶表面残余的硅羟基进行反应，这一处理方法被称为“封端”(Endcap)。对于正相吸附剂和离子交换吸附剂，次级相互作用并不被排斥或影响不显著，因而不必进行封端处理。硅胶键合吸附剂硅胶键合吸附剂硅胶键合吸附剂vC18对非极性、弱极性以及中等极性化合物具有广泛保留，是目前固相萃取中应用最广的吸附剂。由于C18链的长链效应，填料的极性作用比其它吸附相都小，因而C18填料对盐没有任何保留。通常可以用C18填料小柱对一些小分子和中等大小分子样品脱盐。此外，在离子分析中，可将含有目标离子的水溶液通过C18柱，溶液中的弱极性干扰物物(比如脂肪、多环芳烃、邻苯二甲酸酯)被吸附剂保留，从而得到纯净的离子溶液。vProElutC18-U是硅胶键合C18后未进行封端处理的反相C18萃取柱。硅胶基质表面残余的硅羟基与极性化合物存在极性相互作用，因而增强了对极性化合物尤其是胺基化合物(比如四环素类药物)的保留，适用于极性和非极性化合物的萃取。vProElutC8在性质上与C18接近，但由于其碳链较短，所以对非极性化合物的保留要比C18的弱；如果样品在C18的小柱上保留太强，难以洗脱时，可以用C8的小柱来代替；由于C8的碳链较短，难以有效地覆盖硅胶表面，所以C8小柱与样品的极性作用要强于C18小柱，但极性作用仍然不是C8小柱的主要特性。v由于乙基链比较短，所以ProElutC2具有相当的极性，当样品在C8和C18的小柱上有强保留时，常常使用C2来代替。C2的极性比CN的极性稍低一些，通常用C2的柱子用于从血浆和血清样品中提取药物。vProElutPH是非极性萃取中常用到的吸附相，极性与C8类似。像环己烷一样，PH表现出相对于其它非极性吸附相稍微不同的选择性，这主要是由于苯环上的电子云密度带来的结果，并且PH吸附相对平面化合物和共轭有机样品的保留比链状吸附相强。vProElutCN是中等极性吸附剂，用于在C8和C18等非极性吸附相上有不可逆保留的强非极性样品的萃取。vProElutSilica中的吸附剂为未键合硅胶，通常被认为是极性最强的吸附剂，表面的硅羟基能够部分解离使其呈弱酸性。特别适合分离结构相似的非极性、弱极性化合物等。vProElutNH2是由硅胶键合氨丙基得到，兼具极性吸附作用和弱阴离子交换作用，可通过弱阴离子交换(水溶液)或极性吸附(非极性有机溶液)达到保留作用。当用在非极性溶液中(如正己烷)进行预处理时，能与带有-OH，-NH或-SH官能团的分子形成氢键。氨基共轭酸的，较SAX弱，在pH7.8水溶液中，可用做弱阴离子交换剂。vProElutPSA由硅胶键合乙二胺基-N-丙基得到，有两个氨基，其共轭酸的pKa值分别为10.1和10.9，与NH2相似但比NH2柱具有更强的离子交换能力。同时PSA可与金属离子产生鳌合作用，用于提取金属离子。vProElutSCX是以硅胶为基质键合对丙基苯磺酸官能团的吸附剂，磺酸基团极易解离而呈阴离子状态，具有较强的阳离子交换性能。并且由于苯环的存在，吸附剂还具有非极性，能与化合物发生非极性相互作用。适合碱性化合物的分离。vProElutSAX为硅胶键合季铵基团的吸附剂，季铵基团始终呈阳离子态，因而具有较强的阴离子交换功能，对阴离子型有机化合物(比如含有羧基、酚羟基的化合物)具有选择性的保留。由于季铵基团上的碳链较短，吸附剂的非极性相互作用较弱。