时间分辨光谱学讲义.pdf
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1、 实验三:时间分辨光谱学实验三:时间分辨光谱学 摘要摘要 在这一实验中你将直接监控溶液分子和这些分子转动中的电子能量转移。除了采用稳态荧光光谱外,纳米时间分辨荧光测量法也将用来完成这些实验。实验目的:1.测定溶液中含给予体和接受体的染料分子溶液的荧光淬火,并与福斯特能量转换理论作比较。这一过程通常称之为 FRET 2.用时间分辨测量法监控溶液中重定位分子的运动。这种方法适用于用斯托克斯爱因斯坦德拜理论测定染料分子的有效分子体积。3.使用你自己装配的虚拟科学仪器 4.用商业的数学软件包发展自己的数据分析程序 注意:在激光实验前,对实验方法要有所了解,对大量数据要进行分析。最基本的要求是在开始本实
2、验前要阅读本文,理解材料内容。此外还需要事先阅读推荐参考文献。注意:在激光实验前,对实验方法要有所了解,对大量数据要进行分析。最基本的要求是在开始本实验前要阅读本文,理解材料内容。此外还需要事先阅读推荐参考文献。.背景背景 A 时间分辨法介绍时间分辨法介绍 多年来,对于化学过程,特别是化学反应速率一直是研究领域中活跃的区域。注意注意:这些材料描述的实验具有潜在的危险性。需要高水平的安全训练,特殊的仪器设备,以及适当的人监督。你承担所有的责任、义务、以及执行这些安全程序措施带来的风险。MIT(麻省理工学院)将不承担材料中所介绍内容的带来的责任、义务及风险 麻省理工学院麻省理工学院 化学学院化学学
3、院 5.33 高等化学实验高等化学实验 2003 下学期下学期 设想一个简单的分解反应:BkA。速率 k 可以简单地通过测定 A 的消耗量(或 B 的生成量)来求得。,根据测定体系中 A(或 B)含量所花的时间可测定反应最大速率。举例来说,你无法用一个耗时 15 秒才能测定 A 含量的仪器来测量1000s-1 的衰退速率。这样的仪器只能测出 15 秒之后的 A 物质的量。考虑一个更物理化的例子。这一例子与我们要做的实验有关。大家应该熟悉edgerton 教授的摄影。他拍摄了高速运动物体的清晰照片,如子弹穿过香蕉等。(如果不清楚,在麻省理工的博物馆中有几幅照片,一定要去看看)当你感兴趣的事情发生
4、时,利用闪光灯,使胶卷在非常短的时间内曝光,就能得到这样的照片。如果想得到 1mm 的分辨率,闪光灯的时间就必须小于子弹飞出 1mm 的时间。否则图像就会变得模糊。在这一实验中,我们将测量能量从一个激发的染料分子(给予体)跃迁到另一个分子(接受体)的速度。这一过程仅仅只需要 500 皮秒(ps=10-12s)。用激光脉冲激发分子,再采用快速荧光检测器测定能量转移的速率。从前面的讨论中我们可以知道,脉冲的周期必须小于几百皮秒,检测器也必须具备相应的速度。B 溶液中染料分子的电子光谱学溶液中染料分子的电子光谱学 染料分子吸收可见光及紫外线导致跃迁至第一电子激发态,S1。这一跃迁的能量是 10410
5、5cm-1*(*单位 cm-1或波数,用于取代焦耳。波数是光的波长的倒数。与能量转换的关系表现为方程/hcE=)电子激发的过程(如图 1 中的 a)非常快(小于1015秒或一皮秒),以致于核在这一过程中并没有改变位置。因为新的电子结构会引起新的平衡核结构,所以激发还伴随着振动激发。振动驰豫和新的激发态溶质分子的重组会消耗了多余的能量。这些无辐射的驰豫过程会迅速平衡激发态(10-1310-12s,或 0.11 皮秒),大约会耗费能量 102103cm-1(热能)这一过程在图一中表示为 b。一旦体系处于激发态的势能最小点,它将通过释放大量能量返回基态,能量值大于104cm-1。由于基态和激发单重态
6、之间具有较大的能量差异,所以能量不容易以热能这种无辐射形式消耗掉。最可能的驰豫机制是通过荧光,通过荧光,被激发的分子发射一种光场(c)。部分激发态分子通过荧光返回基态(与其他途径相反)的荧光量子产率,D。用荧光法测量弛豫的时间荧光的寿命通常比初始时间大得多(10-1010-8s,0.11ns)。由于振动弛豫过程在激发之后,而且也由于激发态的原子核的位移,荧光的发射波长通常大于吸收。溶液中观测到的吸收和荧光光谱表现出典型的镜像对称性,并且光谱峰出现分离,2,被称之为斯托克斯位移。图一:溶液中染色分子的电子态。吸收光(a)导致电子跃迁至第一激发态。这一跃迁伴随着快速驰豫(b)至一新的扩张的电子核结
7、构。发出荧光后(c)系统回到基态。荧光频率低于吸收频率。它表示吸收过程中通过振动弛豫消耗掉的能量值。荧光光谱法是一种用来探察电子结构及电子激发态动力学的方法。对气相分子,荧光光谱(荧光强度作为频率函数)与分子的量子力学电子结构有关。在溶液中,光谱不具备特征性,但荧光是测量电子激发态动力学的有力工具(含时行为)。荧光的强度 If与激发态分子数量 N 成正比。N 的数值随着分子返回激发态而改变:)()(tNtIf (1)因此通过观察样品发射的随时间变化(通常只有几纳秒)的荧光强度可以直接测量弛豫速率。激发态的一阶弛豫速率方程为:(2)可知荧光强度随着荧光衰减速率 Kf呈指数下降)exp()(0tk
8、ItIf=(3)f1/kf指的是荧光强度减至(1/e)I0时的荧光寿命需。图 2 是一个时间分辨荧光衰减的例子。实验实验 A.用于瞬态和稳态测量的荧光计用于瞬态和稳态测量的荧光计 助教(TA)能帮助你熟悉光学设备,指示你如何使用示波器和电脑来获取数据。荧光计由一个激发臂和一个检测臂组成。激发臂发出激励光激发给予体分子,检测臂检测样品发出的荧光。所有的荧光测量都由 4470 室的激光激发源来完成,如图 4 所示。激发光束为一小 Nd:YAG(NeodymiumdopedYittrium 图 2:时间分辨荧光衰减 Aluminum Garnet)激光,产生的脉冲光大约为 600ps 长,波长为 5
9、32nm。激光每隔 200us 发射出脉冲光(5 Hkz 的重复率)。当此光聚焦在样品之前,有一个起偏器垂直地对光偏振。在与激发光垂直 90 度的方向收集样品发射的荧光。测量臂中的起偏器允许平行()或垂直()的偏振荧光通过。透镜将荧光映射在检测器上,滤波器把剩余的激发光或不需要的荧光频率屏蔽掉。瞬时荧光测量法所用的检测器是一个快速光电二极管,时间分辨率大约为500ps。它能测量给定时间间隔内样品发出的荧光强度。时间分辨率为 400ps 的示波器可测量光电二极管中的信号。示波器的轨迹由激光头发出的脉冲发射。这一设备所有的时间分辨率是由脉冲长度、检测器速度、示波器速度决定,大约为(6002+500
10、2+4002)ps870ps。实践中,你可以通过把少量的激发光发射入检测器直接测量此值。对于稳态激光光谱测量法,荧光被聚焦在分光计的狭缝处。分光计里的光栅把荧光发散,进入阵列检测器,检测器能看到样品发射的从可见到近红外范围的所有的荧光光谱。对每一检测器,把检测头(head)大致放在荧光聚焦处,然后使用千分尺调节检测器的位置,使信号最大化。检测器的响应处于平直的顶部说明检测器达到饱和,应该减小激发强度或插入中性密度滤波器以减弱荧光信号。B.激光安全性激光安全性 新实验室正在装备一个高密度固态激光光源。其他的有关激光的一些危险化学和能源供应不是本实验所关心的问题。然而,这种细小激光源发出的光对于进
11、入激光使用中的实验室的任何人而言仍然具有潜在的、严重和永久性的伤害。这并不是我们惧怕激光的原因,但却是我们重视激光的主要原因。即使只是光束的一部分直接射入眼睛也可能会对眼睛造成无法挽回的伤害。所以,在激光周围工作时,必须具备一些基本常识。做本实验时在储存间必须检查的实验所需的特制激光安全护目镜。这种护目镜有两个不同的滤波器,因为在这房间里有两种不同的颜色 图 4:用于瞬态和稳态的荧光计示意图 或波长的光。激光护目镜上的一个滤波器可以屏蔽激光头发出的、肉眼无法看见的少量红外光,另一个滤波器可以屏蔽肉眼明显可见的绿光。因为本实验里使用绿光,而它不能被完全除尽,所以用此镜保护眼睛不受绿光伤害。助教尤
12、其要小心,要保证所有的光束都保持在光学工作台的水平方向(也就是说,当你站着的时候,没有光束会朝向你的双眼)。不要把肉眼与激光束置于同一水平面,所以当你弯腰拾起掉落在地板上的物品时要紧闭双眼。随时随地戴上护目镜。如果严格遵循了这些原则,就能确保受伤害的危险性最小小。本实验中我们所测定样品荧光是没有危险性的。可以不用取下护目镜,完成本实验(包括把荧光导入检测器和对信号最优化)。如果你对与激光工作感觉不适,把干扰你工作的细节问题告诉助教,他们将对激光安全问题与你做更详尽的讨论 .能量转移能量转移 A.背景背景 对于一个孤立的处于电子激发态的分子来说,弛豫的机制主要是辐射,即在返回基态的过程中发出的分
13、子荧光。这种辐射机制同样适用于被大量溶剂分子包围着的染料分子的稀溶液。但浓度更大的溶液还存在其它的弛豫途径,如染料分子间相互作用引起的弛豫途径。当分子间距离在 10100,一个分子中处于激发态的电子运动能给另一个分子施加一个库仑力,这使得激发从一个分子“跳跃”至另一个分子。设最初处于激发态的分子为给予体(D),能量跳跃所至的分子为接受体(A)。这一过程,就被称为能量转移,如下所示 *号表示电子激发态。因此,给予体返回基态伴随着接受体受激发至激发态,然后荧光接受体最终也返回基态。对这一过程完整的描述是量子力学(例如,Forster或 CohenTannoudji),但是经典模型能够为我们建立这一
14、过程的物理图形提供所需的大多数信息。一个最简单的描述就是两个弹簧振子(把给予体和接受体当作弹簧连接的物体),这两个振子通过弹簧连接在一起。把其中一个振子从平衡位置移开,会导致第二个振子振动,其振动的速率与连接这两个物体的弹簧的力常数成正比。附录 1 中描述了更多的细节。导致能量转移的库仑作用是一种偶极偶极相互作用,它与传送天线和接受天线之间的关系相似。如果两个偶极(或天线)之间的距离为 R,相互作用的强度(势能)为 1/R3。你可以回顾物理化学书,例如 Atkin(见参考文献),或普通物理课本中的偶极偶极相互作用。福斯特(见参考文献)发展了一种接受体和给予体偶极的能量转移理论,指出从给予体到接
15、受体的能量转移速率与 1/R6成正比:D 是孤立的给予体分子的荧光衰减时间。在福斯特理论中的基本物理量是R0,即临界转移距离。如果一个给予体和一个接受体之间的距离为 R0,那么处于电子激发态的给予体分子通过荧光弛豫的可能性和其通过能量转移至接受体从而达到弛豫的可能性一样大。公式 5 表明如果 RR0,能量转移的速率会迅速的改变,R0通常在 10 到 100 之间。所以,如果已知 R0,能量转移速率的测量法可用做分子水平的距离测量(一种分子直尺)。福斯特的 R0可由一些实验观测值来计算。fD为给予体的荧光光谱,A为接受体的吸收光谱,JDA是重叠积分,它表示光谱重叠的程度。这一积分表示,给予体发射
16、和接受体吸收之间必须存在共振才能发生有效的能量转移。v 表示以波数为单位(cm-1)的频率。荧光光谱必须标准化到单位面积的,以便 fD(v)为 cm1/(cm-1)。吸收光谱必须用十进制的摩尔消光系数表示(liter/mol cm=(M cm)-1),根据比尔定律 AA(v)lC,A 是吸光率或光学强度,A(v)是一定频率下的摩尔消光系数,C 是浓度,l 是光程长度。n 为溶剂的折光指数,N 为阿弗加得罗常数。2是反映电子偶极相对方向的常数,对于转动速率快于分子能量转移速率的分子来说,2值为 2/3。D 是给予体荧光量子产率。由于 R0的单位是 cm,公式 6 通常也写为:对于溶液中染料分子而
17、言,R0通常为 10100,能量转移的速率 kDA(0.11ns-1),通常和浓度约为 10-3M 的接受体溶液的荧光速率相似。在这一界限(10100)内,处于电子激发态的给予体有两种有效的衰减途径:荧光和能量转移至给予体。对于明显分开的给予体和接受体分子而言,荧光和能量转移速率之和可作为呈指数衰减的荧光速率。在溶液中,由于存在给予体接受体的距离分布,这将就使得问题更加复杂(见下)。正如公式 6 所示,能量转移最重要的条件是共振。给予体的荧光光谱代表了激发的给予体偶极的振动频率。它必须和从基态跃迁至激发态的接受体的电子转移频率(也就是吸收光谱)相匹配。重叠积分 JDA的大小代表频率匹配的程度。
18、如果激发态给予体和基态接受体之间不存在共振,能量转移就不可能。因此,能量转移机制通常被称为福斯特共振能量转移(或 FRET)共振和振动弛豫表明 FRET 是一个能量下降过程。给予体的荧光频率低于给予体的吸收频率。同样地,一旦能量从给予体转移到接受体,被激发的接受体的振动弛豫会消耗掉比初始激发能更多的能量,以保证能量不会跳跃回给予体。在给予体的浓溶液中,给予体荧光和吸收光谱的部分重叠允许能量在通过其他途径弛豫之前,从一个给予体分子跳跃至另一个给予体分子。此外,两个电子态之间的相互作用造成了多种能量转移途径:FRET,交换相互作用,辐射耦合。辐射耦合,有时候被认为是次要的机制或两步机制:给予体荧光
19、发射和随之的接受体的荧光吸收,。这种机制取决于样品长度,出现在分子间距离长或者说稀溶液里。交换相互作用需要给予体和接受体轨道的电子态相互重叠,因此此作用只能在短距离内有效。更多的解释见 Birks 或 Fleming 共振能量转移是光合作用和光捕获(见参考文献)中极其重要的过程。植物和光合作用的细菌利用大量叶绿素和类胡萝卜素排列成近似环状的结构,吸收光并让激发能通过能量转移过程进入反应中心,最初的光合电荷分离结果发生在此反应中心。在光捕获排列中,类胡萝卜素和最外面的叶绿素吸收最高能量的光,把这些光通过一个泻落的过程转移至其他靠近中心的具有较低能量的叶绿素。不同叶绿素分子的蛋白质环境变化使得在此
20、序列的叶绿素给予体和吸收体的光谱重叠。反应中心自身就是具有更低的吸收能量的叶绿素分子。能量转移测量现在更多用作溶液中的分子尺,比如可用作测量蛋白质中氨基酸残基和辅基之间的距离。在实验的第一部分,我们将测量染料溶液中给予体和接受体分子的能量转移。我们将通过配置给予体的稀溶液和不同浓度的接受体溶液,由此来改变给予体分子和接受体分子之间的平均距离。采用时间分辨荧光法和稳态荧光法测定这些溶液的临界转移距离 R0。对于这些溶液,接受体分子随着给予体分子数量(浓度)的变化而呈现统计分布。由于任一给予体/接受体对的能量转移所引起的给予体个数的减少(按照公式 5所给出的速率而减少),使得给予体/接受体距离发生
21、改变,正如能量转移速率一样。在这样的溶液中要获得给予体的含时个数,必须把能量转移的速率在所有的 R 进行平均。这种总体平均给出了一个激发态分子的含时衰减的表达式,也就是含时荧光测量:这里的 nA是接受体分子的数目密度。注意,给予体衰减有两种方式:给予体发出荧光或能量转移至接受体。给予体荧光衰减通常呈指数衰减,而能量转移则是以时间平方根的指数衰减。公式 8 表示可以通过研究不同接受体浓度的溶液来正确获得 Ro。从公式 8 中同样可以得到接受体瞬时荧光衰减。接受体的荧光将随着给予体荧光寿命衰减而降低,但随给予体到接受体的能量转移速率(见公式 8 的第二项)增加而增加。这些公式在福斯特的原著和 Fl
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