LC∕MS∕MS技术与应用.pdf
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1、LC/MS/MS技术与应用技术与应用南方医科大学卫生检测中心马安德1.质谱基本知识质谱基本知识1.1 质谱的产生化合物的离子化质谱的产生化合物的离子化M+e-M+2e-或或M+e-M-M+H+MH+或或M(H+)M-H-M+Na+MNa+M+NH4+MNH4+M+K+MK+M+X MXM+nH+(MHn)n+n+?质荷比质荷比质荷比质荷比 m/z(m/z(ratio of mass to charge),ratio of mass to charge),相对丰度相对丰度相对丰度相对丰度%(%(relative relative abundance)abundance);?质谱含有样品分子或原子
2、的质量信息;质谱含有样品分子或原子的质量信息;质谱含有样品分子或原子的质量信息;质谱含有样品分子或原子的质量信息;?质谱图是化合物的一种化学指纹图谱,质谱图是化合物的一种化学指纹图谱,质谱图是化合物的一种化学指纹图谱,质谱图是化合物的一种化学指纹图谱,可以给出大量的结构信息。可以给出大量的结构信息。可以给出大量的结构信息。可以给出大量的结构信息。1.质谱基本知识质谱基本知识1.2 质谱图表达的信息质谱图表达的信息1.质谱基本知识质谱基本知识1.3 质谱仪器的基本结构质谱仪器的基本结构真空系统真空系统进样系统进样系统检测器检测器数据系统数据系统质量分析器质量分析器离子源离子源大气压大气压1.质谱
3、基本知识质谱基本知识1.4 质谱仪器类型质谱仪器类型同位素质谱无机质谱有机质谱同位素质谱无机质谱有机质谱按质量分析器分类按联用方式分类磁质谱四极杆质谱(Q-MS)飞行时间质谱(TOF-MS)离子阱质谱(IT-MS)离子回旋共振质谱(ICR-MS)气相色谱/质谱(GC/MS)液相色谱/质谱(LC/MS)毛细管电泳/质谱(CE/MS)质谱/质谱(MS/MS)1.质谱基本知识质谱基本知识1.4质谱仪器类型有机质谱仪的关键组成质谱仪器类型有机质谱仪的关键组成进样系统 接口 离子源 质量分析器检测器 直接引入 直接连接 电子轰击 EI 电子倍增管 气相色谱 喷嘴分离器 化学电离 CI 磁 场 电 场 双
4、聚焦 流动注射 机械传送 快原子轰击 FAB 四极杆 光电倍增管 液相色谱 粒子束 PB 场致电离 FI 离子阱 ITD 毛细电泳 热喷雾 TS 场解析 FD 飞 行 时 间TOF 电喷雾 ESI 离子喷雾 IS 基质辅助激光解吸电离 MALDI 离 子 回 旋 共振 ICRMS 大 气 压 化 学电离 APCI 注:TS、ESI、IS、APCI 兼有离子化的功能 1.质谱基本知识质谱基本知识1.4.1 质谱仪器类型质谱仪器类型-飞行时间质量分析器飞行时间质量分析器开始时,所有离子都在一起。小的离子移动的快,大的离子移动的慢,根据到达检测器时间的不同,而检测出不同质量的离子。具体可表示为:开始
5、时,所有离子都在一起。小的离子移动的快,大的离子移动的慢,根据到达检测器时间的不同,而检测出不同质量的离子。具体可表示为:m/z=2Ut2/d2=kt2 (k=2U/d2)m/z t2U:加速电场强度;:加速电场强度;d:飞行管长度可以采用两级加速或反射式提高仪器的分辨率:飞行管长度可以采用两级加速或反射式提高仪器的分辨率+d1.质谱基本知识质谱基本知识1.4.2 质谱仪器类型质谱仪器类型-四极杆质量分析器四极杆质量分析器+由一组平行放置的四根金属棒构成由一组平行放置的四根金属棒构成由一组平行放置的四根金属棒构成由一组平行放置的四根金属棒构成,用陶瓷绝缘用陶瓷绝缘用陶瓷绝缘用陶瓷绝缘,交交交交
6、错地联结成两对;错地联结成两对;错地联结成两对;错地联结成两对;加以方向相反的直流加以方向相反的直流加以方向相反的直流加以方向相反的直流(DC)(DC)(DC)(DC)和射频和射频和射频和射频(RF)(RF)(RF)(RF)电压;电压;电压;电压;加速离子进入分析器加速离子进入分析器加速离子进入分析器加速离子进入分析器,并按并按并按并按m/zm/zm/zm/z和和和和RF/DCRF/DCRF/DCRF/DC值开始以一值开始以一值开始以一值开始以一种复杂的形式振荡种复杂的形式振荡种复杂的形式振荡种复杂的形式振荡,稳定振荡的离子通过打拿极射稳定振荡的离子通过打拿极射稳定振荡的离子通过打拿极射稳定振
7、荡的离子通过打拿极射到倍增器上被放大记录到倍增器上被放大记录到倍增器上被放大记录到倍增器上被放大记录,不稳定振荡的离子打到四不稳定振荡的离子打到四不稳定振荡的离子打到四不稳定振荡的离子打到四极杆上被中和极杆上被中和极杆上被中和极杆上被中和,从而达到质量分离目的从而达到质量分离目的从而达到质量分离目的从而达到质量分离目的.1.质谱基本知识质谱基本知识1.4.2 质谱仪器类型质谱仪器类型-四极杆质量分析器四极杆质量分析器串联三级四极杆质量分析器1.质谱基本知识质谱基本知识1.4.3 质谱仪器类型质谱仪器类型-离子阱质量分析器离子阱质量分析器?由环形电极和两个端盖电极构成。由环形电极和两个端盖电极构
8、成。由环形电极和两个端盖电极构成。由环形电极和两个端盖电极构成。?离子被引入阱中后离子被引入阱中后离子被引入阱中后离子被引入阱中后,经经经经RFRFRFRF射频电压扫射频电压扫射频电压扫射频电压扫描描描描,不同质荷比的离子相继排出得到不同质荷比的离子相继排出得到不同质荷比的离子相继排出得到不同质荷比的离子相继排出得到检测。检测。检测。检测。?由于离子在阱内可存储较长的时间由于离子在阱内可存储较长的时间由于离子在阱内可存储较长的时间由于离子在阱内可存储较长的时间,增加了离子相互碰撞的机会增加了离子相互碰撞的机会增加了离子相互碰撞的机会增加了离子相互碰撞的机会,适用于适用于适用于适用于气相离子反应
9、研究。气相离子反应研究。气相离子反应研究。气相离子反应研究。?突出优点在于高灵敏度(低至突出优点在于高灵敏度(低至突出优点在于高灵敏度(低至突出优点在于高灵敏度(低至10101010 18181818克克克克分子)、快速扫描(分子)、快速扫描(分子)、快速扫描(分子)、快速扫描(5000500050005000道尔顿道尔顿道尔顿道尔顿/秒)秒)秒)秒)以及可在一个离子阱检测器内实现程以及可在一个离子阱检测器内实现程以及可在一个离子阱检测器内实现程以及可在一个离子阱检测器内实现程序扫描多级串联质谱功能。序扫描多级串联质谱功能。序扫描多级串联质谱功能。序扫描多级串联质谱功能。1.质谱基本知识质谱基
10、本知识1.4.4 质谱仪器类型质谱仪器类型-四极杆四极杆/线性离子阱质量分析器线性离子阱质量分析器Q0Q0Q1Q1Q2Q2Q3Q3Ion trap MS Ion trap MS Mass SelectionMass SelectionIon AccumulationIon Accumulation(patented)(patented)Fragment Ion GenerationFragment Ion Generation1、在串联四极杆的基础上,将、在串联四极杆的基础上,将Q3设计成线性离子阱设计成线性离子阱2、Q2中实现第一次的碎裂,进入中实现第一次的碎裂,进入Q3分析分析 空间串联空
11、间串联3、Q3的离子阱功能,可以进一步进行的离子阱功能,可以进一步进行Frag/scan,MSn时间串联时间串联1.质谱基本知识质谱基本知识1.5 质谱分析过程质谱分析过程进样离子化离子分离离子检测质谱图控制与处理2.联用技术联用技术2.1 气相色谱气相色谱/质谱联用质谱联用 进样方式样品气化后进入质谱仪;离子化方式电子轰击(EI),建有标准谱库,并可自谱库中检索出可能的化合物分子结构;用毛细管色谱柱分离化合物,分离效率高(一次可分离几十上百组分);操作条件稳定,使用方法成熟;适宜分析小分子、易挥发、热稳定的化合物;已成为常规实验室装备仪器。2.联用技术联用技术2.2 液相色谱液相色谱/质谱联
12、用质谱联用 高效液相色谱(HPLC)是分离化合物范围最广,准确度高,对化合物破坏性小的快速分离方法,特别适用于有机生物分子的分离。质谱仪(MS)是灵敏度很高,对未知化合物的结构分析定性准确,对被测定化合物和相应标准样品的了解要求较低的定性手段。2.联用技术联用技术2.2.1 LC/MS连接时的主要问题连接时的主要问题?难挥发和/或热不稳定被分析物的离子化;?流速不兼容:LC的传统柱流速1ml/min.或更高,而MS需在高真空条件下工作;?流动相不兼容:LC分离时经常加不挥发性的缓冲液、添加剂等。2.联用技术联用技术难挥发和/或热不稳定被分析物的离子化:应用软电离技术 快原子轰击(FAB);热喷
13、雾(TS);电喷雾(ESI);基质辅助激光解吸离子化(MALDI)。2.联用技术联用技术 尽量不使用不挥发性的流动相;用挥发性溶剂置换不挥发性的缓冲液;使用柱上连续流动液液萃取技术;利用双柱,进行相切换;利用微膜离子抑制系统。流动相不兼容:流动相不兼容:2.联用技术联用技术流速不兼容:流速不兼容:质谱仪离子源配置足够大抽气量的真空泵;在进入质谱仪高真空区之前除去大量溶剂;采用适当的分流装置;使用小内径的LC柱降低流速。通常几种方法并用3.液相色谱液相色谱/质谱接口质谱接口3.1 接口种类接口种类(20余种余种)直接导入界面 传送带界面 渗透薄膜(或管)界面 热喷雾界面(TSP)离子束界面(PB
14、I)等 大气压电离(API)3.液相色谱液相色谱/质谱接口质谱接口3.2 大气压电离大气压电离(API)接口与电离相结合接口与电离相结合 在常压下电离,仅把带电离子“吸入”质谱;由于可带多个电荷,可以测到十几万Dr 的分子量。缺点:不能提供经典的质谱图缺点:不能提供经典的质谱图目前大气压电离特指:?电喷雾电离(ESI)?离子喷雾(IS)?大气压化学电离(APCI)4.离子蒸发与大气压电离离子源离子蒸发与大气压电离离子源4.1 电喷雾电喷雾(ESI)电喷雾电离是一种“软电离”技术,是目前应用最多的电离技术之一。1984年美国耶鲁大学教授J.Fenn等首次发表ESIMS的研究成果,并于1988年成
15、功地进行蛋白质的分析。4.离子蒸发与大气压电离离子源离子蒸发与大气压电离离子源4.1 电喷雾电离电喷雾电离(ESI)ESI接口:接口:4.离子蒸发与大气压电离离子源离子蒸发与大气压电离离子源4.1 电喷雾电离电喷雾电离(ESI)离子化过程示意图:离子化过程示意图:+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+喷雾针溶剂蒸发离子蒸发+不挥发的残粒4.离子蒸发与大气压电离离子源离子蒸发与大气压电离离子源4.2 大气压化学电离大气压化学电离(APCI)APCI接口:接口:4.离子蒸发与大气压电离离子源离子蒸发与大气压电离离子源4.2 大气压化学电离大气压化学电离(APCI)离子化
16、过程示意图:离子化过程示意图:样品M喷雾针喷雾针放电针放电针XXMXH+XXMXXMXH+XMXH+XH+MH+MCurtain gasCurtain plateX=solvent molecules,e.g.H2O、NH2etc.4.3 基质辅助激光解吸附电离 MALDI基质辅助激光解吸附电离 MALDI(Matrix Assisted Lasser Desorption Ionization)4.34.3 基质辅助激光解吸附电离基质辅助激光解吸附电离基质辅助激光解吸附电离基质辅助激光解吸附电离 MALDIMALDIMALDIMALDI(Matrix Assisted(Matrix Assi
17、sted LasserLasser DesorptionDesorption Ionization)Ionization)4.离子蒸发与大气压电离离子源离子蒸发与大气压电离离子源?新生儿筛查是对一些目前还无法在产前做出诊断的先天性疾病在新生儿进行普查,以筛选出病人,提前做出诊断,提前进行治疗先天性疾病中大部分属于先天性遗传代谢疾病,目前已经知道的不下上百种这些疾病多数不致死,但可以严重影响患儿的智力和体格,造成痴呆等疾病和残缺以及畸形等,给家庭,社会,国家带来沉重的负担。5.LC/MS/MS的应用的应用5.1 新生儿疾病的筛查新生儿疾病的筛查5.LC/MS/MS的应用的应用5.1 新生儿疾病的
18、筛查新生儿疾病的筛查目前应用目前应用LC/MS/MS可临床检测可临床检测30多种遗传性代谢失常疾病如:多种遗传性代谢失常疾病如:各种氨基酸代谢失常血症包括同构胱氨酸尿症、瓜氨酸血症、酪氨酸血症、超苯丙氨酸血症、精氨酸酶缺乏症、精氨琥珀酸尿症和各种超甲硫氨酸血症;短链和长链酰基辅酶各种氨基酸代谢失常血症包括同构胱氨酸尿症、瓜氨酸血症、酪氨酸血症、超苯丙氨酸血症、精氨酸酶缺乏症、精氨琥珀酸尿症和各种超甲硫氨酸血症;短链和长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症脱氢酶缺乏症(SCAD和和LCAD)、异戊酸血症、丙酸血症、甲基丙二酸血症、戊二酸血症和其它各种有机酸代谢失常疾病等。、异戊酸血症、丙酸血症、甲基丙二酸血
19、症、戊二酸血症和其它各种有机酸代谢失常疾病等。现在新生儿筛查主要是针对:?先天性甲状腺功能低下(服用甲状腺激素可以完全避免痴呆的发生);?苯丙酮尿症(只要不服用含有苯丙氨酸的包括人奶在内的食品就可以完全避免痴呆的发生);?半乳糖血症(只要不服用含有乳糖的包括人奶在内的食品就可以完全避免痴呆的发生)。5.LC/MS/MS的应用的应用5.1 新生儿疾病的筛查新生儿疾病的筛查5.LC/MS/MS的应用的应用5.1 新生儿疾病的筛查新生儿疾病的筛查新生儿筛查的一般过程:2.100ul 甲醇溶液(标准)1.取样3.上清液50吹干4.50ul 正丁醇溶液衍生5.吹干,再溶解35ul5.LC/MS/MS的应
20、用的应用5.1 新生儿疾病的筛查新生儿疾病的筛查利用电喷雾串联质谱分析苯丙酮尿症利用电喷雾串联质谱分析苯丙酮尿症(PKU)5.LC/MS/MS的应用的应用5.1 新生儿疾病的筛查新生儿疾病的筛查17例新生儿疾病筛选结果5.LC/MS/MS的应用的应用5.2 药物代谢结合物的测定药物代谢结合物的测定葡萄糖苷酸及硫酸盐结合物数据来源:American Society for Mass Spectrometry,20025.LC/MS/MS的应用的应用5.2 药物代谢结合物的测定药物代谢结合物的测定GC/MS12%LC/MS3%GC/MS12%LC/MS3%1990年HPLC85%HPLC85%20
21、00年LC/MS80%LC/MS80%HPLC15%GC/MS5%HPLC15%GC/MS5%5.LC/MS/MS的应用的应用5.3 天然产物的分析天然产物的分析植物组织培养物中的Taxol总离子流色谱图总离子流色谱图Taxol质谱图质谱图5.LC/MS/MS的应用的应用5.3 天然产物的分析天然产物的分析植物组织培养物中的植物组织培养物中的Taxol液质联用图液质联用图5.LC/MS/MS的应用的应用5.4 生物技术生物技术分子量测定分子量测定牛胰岛素牛胰岛素分子量分子量5731.685.LC/MS/MS的应用的应用5.4 生物技术生物技术分子量测定分子量测定牛胰岛素牛胰岛素(M+5H)5+
22、子离子图子离子图5.LC/MS/MS的应用的应用5.4 生物技术生物技术分子量测定分子量测定+Q1:10 MCA scans from Sample 1(TP5-20030101)of 20030113.wiff(Turbo Spray)Max.1.2e8 cps.5006007008009001000110012001300140015001600m/z,amu1.00e72.00e73.00e74.00e75.00e76.00e77.00e78.00e79.00e71.00e81.10e81.20e8680.31360.3702.3663.31381.9565.5718.31587.383
23、6.51244.31020.31403.91272.81215.9946.51095.1924.3胸腺五肽ESI质谱图M=1359+Q1:10 MCA scans from Sample 1(LBRLstandard)of 20020809.wiff(Turbo Spray)Max.1.0e7 cps.5006007008009001000110012001300140015001600m/z,amu5.00e51.00e61.50e62.00e62.50e63.00e63.50e64.00e64.50e65.00e65.50e66.00e66.50e67.00e67.50e68.00e68.
24、50e69.00e69.50e61.00e71210.9689.2667.7776.3962.5798.81068.81233.1919.01273.21184.8608.01418.81543.91437.1722.35.4 生物技术生物技术分子量测定分子量测定M=1209.85.LC/MS/MS的应用的应用醋酸亮丙瑞林ESI质谱图+Q1:10 MCA scans from Sample 6(SSTstandard)of 20030113.wiff(Turbo Spray)Max.3.6e7 cps.700800900100011001200130014001500160017001800m
25、/z,amu2.0e64.0e66.0e68.0e61.0e71.2e71.4e71.6e71.8e72.0e72.2e72.4e72.6e72.8e73.0e73.2e73.4e73.6e7819.81638.91637.4811.2830.8756.01660.21132.31026.81244.4952.51680.71509.81272.31537.71430.65.4 生物技术生物技术分子量测定分子量测定M=1638C76H104N18O19S25.LC/MS/MS的应用的应用醋酸生长抑素ESI质谱图5.LC/MS/MS的应用的应用5.4 生物技术生物技术分子量测定分子量测定用离子喷
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