荧光定量PCR实验指南.pdf
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1、荧光定量荧光定量 PCR 实验指南实验指南 一、基本步骤:1、目的基因(DNA 和 mRNA)的查找和比对;2、引物、探针的设计;3、引物探针的合成;4、反应体系的配制;5、反应条件的设定;6、反应体系和条件的优化;7、荧光曲线和数据分析;8、标准品的制备;二、技术关键:1、目的基因(目的基因(DNA 和和 mRNA)的查找和比对;)的查找和比对;从 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/网点的 genbank 中下载所需要的序列。下载的方式有两种:一为打开某个序列后,直接点击“save”,保存格式为“.txt”文件。保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后
2、,再打开 DNAstar 软件中的 Editseq 软件,点击“file”菜单中的“import”,打开后点击“save”,保存为“.seq”文件。另一种直接用 DNAstar 软件中的 Editseq 软件,点击“file”菜单中的“open entrez sequence”,导入后保存为“.seq”文件,保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后要对所有的序列进行排序。用 DNAstar 软件中的 Seqman 软件,点击“sequence”菜单中的“add”,选择要比较的“.seq”的所有文件,点击“add”或“add all”,然后点击“Done”导入要比较的序列,再
3、点击“assemble”进行比较。横线的上列为一致性序列,所有红色的碱基是不同的序列,一致的序列用黑色碱基表示。有时要设定比较序列的开始与结尾。有时因为参数设置的原因,可能分为几组(contig),若想全部放在一组中进行比较,就调整“project”菜单下的“parameter”,在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为 80,可调低即可。再选择几个组,点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下,尽量提高“minimum math percentag
4、e”的值。有时因此个别序列原因,会出现重复序列,碱基的缺失或插入,要对“contig”的序列的排列进行修改,确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。然后,点击“save”保存即可。分析时,主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色,对于弥散性的红色是不可用的。2、引物和探针设计引物和探针设计 2.1 引物设计引物设计 生物秀-专心做生物细心地进行引物设计是 PCR 中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点:序列选取应在基因的保守区段;扩增片段长度根据技术
5、的不同有所分别:sybr green I 技术对片段长度没有特殊要求;Taqman 探针技术要求片段长度在 50bp150bp;避免引物自身或与引物之间形成 4 个或 4 个以上连续配对;避免引物自身形成环状发卡结构;典型的引物 18 到 24 个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于 24 核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量。Tm 值在 5565,GC 含量在 40%60%;引物之间的 TM 相差避免超过 2;引物的 3端避免使用碱基 A;引物的 3端避免
6、出现 3 个或 3 个以上连续相同的碱基。为避免基因组的扩增,引物设计最好能跨两个外显子。2.2 Taqman 探针设计探针设计 一般设计原则:一般设计原则:探针位置尽可能地靠近上游引物;探针长度通常在2535bp,Tm值在6570,通常比引物TM高510,GC 含量在 40%70%。探针的 5端应避免使用碱基 G。整条探针中,碱基 C 的含量要明显高于 G 的含量。为确保引物探针的特异性,最好将设计好的序列在 blast 中核实一次,如果发现有非特异性互补区,建议重新设计引物探针。(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)2.3 Taqman MGB 探针设计介绍探针设计介绍
7、MGB 探针的优点:MGB 探针较短(14-20bp),更容易找到所有排序序列的较短片段的保守区。短片段探针(14-20bp)加上 MGB 后,Tm 值将提高 10,更容易达到荧光探针 Tm 值的要求。MGB 探针的设计原则 探针的 5端避免出现 G,即使探针水解为单个碱基,与报告基团相相连的 G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。用 primerexpress 软件评价 Tm 值,Tm 值应为 65-67。尽量缩短 Taqman MGB 探针,但探针长度不少于 13bp。生物秀-专心做生物 尽量避免出现重复的碱基,尤其是 G 碱基,应避免出现 4 个或 4 个以上的G 重复出现。原则上 MGB 探针
8、只要有一个碱基突变,MGB 探针就会检测到(MGB 探针将不会与目的片段杂交,不产生荧光信号)。因此,在进行 SNP 检测时,为了检测到突变子,即 Taqman MGB 不与目的片段杂交,不产生荧光信号,探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变位点尽量放在中间 1/3 的地方。注意:为了满足上述要求的 4 个条件,探针的突变位点可向 3端移动,但突变位点至少在离3端 2 个碱基的前方(即必须确保探针的后两个碱基是绝对的保守),以进行 SNP检测。反过来,若要进行同类检测,找的是保守片段区,探针中不应有突变位点。若探针即便是只有 13 个 bp,探针仍不完全保守。有几个突变,突变位点也应靠近探针
9、的 5端,这样,即便是突变,探针也可与目的片段杂交,产生荧光信号。另一种方法是设计简并探针,也可达到即使是突变,仍可检测到突变。2.4 实时多重实时多重 PCR 探针的选择:探针的选择:多重实时 PCR 的多种含意有两种:一为选择保守的探针和引物,利用不同的染料标记探针,在检测时可根据荧光的颜色来判定不同的产物。另一种为选择保守的引物,扩增不同长度的目的片段,反应中加入 SYBRN 染料,最后根据不同目的片段的 Tm 值来判定不同的物品。多重实时 PCR 的荧光探针应为同一类型:如同时为 Taqman 探针、或同时为 MGB探针、或同时为 Beacon 探针。在多重 PCR 中,多重 PCR
10、的各个引物之间相互干扰和各个探针之间相互干扰分析:设计好各对引物和探针后,重新在用 DNAstar 软件中的 Primerselect 软件,打开保守在同一文件中的多重 PCR 的引物文件,然后两两分别选中所设计的多重引物或两两分别选中所设计的多重探针后,在“report”菜单下“primer pair dimers”,分析上下游引物的dimers。弹出的窗口中就告诉此对引物有多少个dimer,并对此对引物用dG值进行评价(通常给出最差的 dG 值,理论上是 dG 值越大越好)。3、影响影响 PCR 及荧光及荧光 PCR 的其他因素的其他因素 引物的设计和选择符合荧光 PCR 的探针并进行设计
11、对于实时荧光 PCR 尤其重要。可以说,不合理的设计意味着绝对的失败。但是,好的设计并不等于好的实验结果,影响 PCR和荧光 PCR 的因素非常多,下面择其重要进行介绍。3.1 引物退火温度引物退火温度 引物的一个重要参数是熔解温度(Tm)。这是当 50的引物和互补序列表现为双链 DNA分子时的温度。Tm 对于设定 PCR 退火温度是必需的。在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度从55到 70。退火温度一般设定比引物的 Tm 低 5。设定 Tm 有几种公式。确定引物 Tm 最可信的方法是近邻分析法。大部分计算机程序使用近邻
12、分析法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。所有 oligo 软件会自动计算引物的 Tm 值。在设置退火温度时可以如下进行:以低于估算的 Tm5作为起始的退火温度,以 2为增量,逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果,两个引物应具有近似的 Tm 值。引物对的 Tm 差异如果超过 5,就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物生物秀-专心做生物Tm 不同,将退火温度设定为比最低的 Tm 低 5。或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm 设计的退火温度先进行 5 个循环,然后再根据较低 Tm 设计的退火温度进行剩
13、余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。3.2 引物浓度引物浓度 引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在 0.1 到 0.5M。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。为了确定引物浓度,可以在 260nm(OD260)测量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数(nmol/OD),通过 Beers 法则(公式公式 1)计算引物浓度。微摩消光系数可以使用公式 2 计算。与大分子双链 DNA 可以使用平均消光系数不同,确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数。这是因为引物较短,碱基组成差异很大。在 oligo软件上可以计算出引物的的消光系数(OD/mol)和消光系数
14、的倒数(mol/OD)。一般商业合成的引物以 O.D.值表示量的多少,在一般情况下,20 个碱基长的引物,1 个O.D.加 100ul 水后引物浓度为 50pmol/ul(50M)。也可以用 OLIGO 软件,根据引物的的消光系数(OD/mol),计算出一定的工作浓度下,引物的加水量。浓度(M)A260(OD/ml)稀释系数消光系数的倒数(nmol/OD)举例:计算某寡核苷酸(溶于 1ml 水中),取其中的 10l 稀释 100 倍(加入 990l)水中。在 A260 处测吸光度为 0.2。计算消光系数的倒数为 4.8 nmol/OD,代入得:浓度0.2(OD/ml)1004.8(nmol/O
15、D)96nmol/ml96M 3.3 引物、探针的纯度和稳定性引物、探针的纯度和稳定性 定制引物的标准纯度对于大多数 PCR 应用是足够的。部分应用需要纯化,以除去在合成过程中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是因为 DNA 合成化学的效率不是 100。这是个循环过程,在每个碱基加入时使用重复化学反应,使 DNA 从 3到 5合成。在任何一个循环都可能失败。较长的引物,尤其是大于 50 个碱基,截断序列的比例很大,可能需要纯化。引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在 TE 重溶引物,使其最终浓度为 100M。也可以用双蒸水溶解。引物的稳定性依赖于储存条件。应
16、将干粉和溶解的引物储存在-20。以大于 10M 浓度溶于 TE 的引物在-20可以稳定保存 6 个月,但在室温(15到 30)仅能保存不到 1 周。干粉引物可以在-20保存至少 1 年,在室温(15到 30)最多可以保存 2 个月。探针即寡核苷酸进行荧光基团的标记,标记本身有效率的区别。探针标记以后一般应该纯化,纯度高、标记效率高的探针不仅荧光值高,且保存时间可以高达一年以上。不同的生物技术公司探针标记效率和纯度有很大的区别。由于反复冻融易导致探针降解,在确认探针质量好的情况下,最好稀释成 2uM(10),作为工作浓度分装多支,避光保存。3.4 热启动热启动 生物秀-专心做生物热启动 PCR
17、是除了好的引物设计之外,提高 PCR 特异性最重要的方法之一。尽管 Taq DNA 聚合酶的最佳延伸温度在 72,聚合酶在室温仍然有活性。因此,在进行 PCR 反应配制过程中,以及在热循环刚开始,保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成,就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时,如定点突变、表达克隆或用于 DNA 工程的遗传元件的构建和操作,热启动 PCR 尤为有效。限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液,并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜,但并不能完全抑制酶的活性,因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。热启动通
18、过抑制一种基本成分延迟 DNA 合成,直到 PCR 仪达到变性温度。包括延缓加入 Taq DNA 聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐,尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分,如镁离子或酶,包裹起来,或者将反应成分,如模板和缓冲液,物理地隔离开。在热循环时,因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样,蜡防护层法比较烦琐,易于污染,不适用于于高通量应用。Transitor Hot Start Taq 酶对于自动热启动PCR来说高效可靠。Transitor Hot Start Taq是在常规 Taq 酶的基础上进行了化学修饰,使得该酶在低温或常温下没
19、有酶活,因此在加样至 PCR 扩增前,不会产生由于引物随机粘连而形成的非特异性扩增。高温条件下,化学修饰集团会被剪切,从而释放酶活。此外,随着 PCR 扩增的进行,酶活会被逐步释放,有效提高扩增效率及产物量。Transitor Hot Start Taq DNA 聚合酶在变性步骤的 95保温过程中要持续 20 分钟才会被释放到反应中,从而完全恢复聚合酶活性。3.5 镁离子浓度镁离子浓度 镁离子影响 PCR 的多个方面,如 DNA 聚合酶的活性,这会影响产量;再如引物退火,这会影响特异性。dNTP 和模板同镁离子结合,降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不
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