液相色谱硬件基础知识2.pdf
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1、1Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited第二部分硬件基础知识2Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.LimitedHPLC简易流程图输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器储液瓶输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器储液瓶数据处理系统脱气机数据处理系统脱气机3Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited储液瓶?由机械性能和化学稳定性好的不锈钢、玻璃或聚四氟乙烯材料制成?使用过程中储液瓶应适当密闭?所有溶剂应先过滤,再装入储液瓶4Shimadzu I
2、nternational Trading(Shanghai)Co.Limited滤膜类型:滤膜类型:聚四氟乙烯滤膜:适用于所有溶剂,酸和盐。醋酸纤维滤膜:不适用于有机溶剂,特别适用于水基溶剂。尼龙66滤膜:适用于绝大多数有机溶剂和水溶液,可以用于强酸,不适用于DMF,THF,CHCl3等溶剂再生纤维素滤膜:蛋白吸收低,同样适用于水溶性样品和有机溶剂溶剂前处理-过滤过滤:过滤:0.45 m或更小孔径滤膜或更小孔径滤膜目的:除去溶剂中的微小颗粒,避免堵塞色谱柱,尤其是使用无机盐配制的缓冲液5Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited脱气:除
3、去流动相中溶解或因混合而产生的气泡脱气:除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡气泡对测定的影响:气泡对测定的影响:1)泵中气泡使液流波动,改变保留时间和峰面积)泵中气泡使液流波动,改变保留时间和峰面积2)柱中气泡使流动相绕流,峰变形)柱中气泡使流动相绕流,峰变形3)检测器中的气泡产生基线波动)检测器中的气泡产生基线波动溶剂前处理-脱气6Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited常用脱气方法?超声脱气?减压脱气?在线脱气7Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited脱气机-在线真空脱气
4、脱气机主要由脱气管、真空室和真空泵组成。真空室内的脱气管由特殊的透析材料制成,当溶剂流经脱气管时,溶解在溶剂中的气体穿过管壁被脱出。到泵储液瓶脱气管真空室8Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited8输液泵输液泵性能要求 能在高压下连续工作 输出流量范围宽 输出流量稳定、精确度、重复性高9Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited目的单元流速范围特性和应用目的单元流速范围特性和应用LC-20AD 0.0001-10ml/min 极低脉动,适于半微量0.0001-5ml/min 和
5、 LC-MS分析LC-20AT 0.001-10ml/min 非凡的耐用性,适于常量分析LC-20AB0.0001-10ml/min 极低脉动,适于半微量LC 和 LC-MS分析分析分析LC-15CLC-30A岛津输液泵系列10Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.LimitedLC-20ATLC-20AT串联式柱塞往复泵串联式柱塞往复泵选配件支架压力传感器泵头主进口单向阀泵头固定座LC-20AT辅助进口单向阀主泵头副泵头主泵头副泵头单向阀11Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.LimitedLC
6、-20ADLC-20AD并联式微体积柱塞往复泵并联式微体积柱塞往复泵选配件支架进口单向阀出口单向阀进液口泵头固定座泵头泵头泵头泵头泵头单向阀单向阀压力传感器LC-20AD12Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.LimitedLC-20ABLC-20AB压力传感器泵头泵头固定座进液口泵A连接块出口单向阀进口单向阀泵BLC-20AB13Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited柱塞往复泵结构示意图14Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Lim
7、ited单向阀结构抛光面球座宝石球单向阀工作原理吸液冲程排液冲程出口单向阀进口单向阀出口单向阀进口单向阀泵头单向阀工作原理15Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited洗脱系统组成洗脱系统组成等度洗脱系统梯度洗脱系统梯度时间时间B%等度时间时间B%高压梯度洗脱系统低压梯度洗脱系统16Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited分析时间长分析时间长分析时间长分析时间长分离度差分离度差分离度差分离度差MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2(column:ODS)使用梯度洗脱的
8、原因当采用等度洗脱时:当采用等度洗脱时:17Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited95%30%甲醇浓度甲醇浓度在最短时间内获得最佳的分离在最短时间内获得最佳的分离使用梯度洗脱的原因当采用梯度洗脱时:当采用梯度洗脱时:18Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited梯度洗脱:梯度洗脱:梯度洗脱:梯度洗脱:优点:可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度注意事项:注意事项:注意事项:注意事项:?溶剂的纯度要高,否则梯度洗脱的重现性差?梯度混合的溶剂互溶性要好?梯度洗脱
9、应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器(如紫外吸收检测器或荧光检测器),而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器(如示差折光检测器)?查看空白实验的数据?遵守分析周期。(最初的分析数据不采用)梯度洗脱要点19Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器单一或混合溶剂单一或混合溶剂单一或混合溶剂单一或混合溶剂等度洗脱20Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited高压梯度系统数据处理系统数据处理系统泵泵泵泵泵泵ABC进
10、样器分析柱柱温箱检测器进样器分析柱柱温箱检测器混合器混合器?梯度准确率高?需要2-3个泵?可以不配在线脱气机21Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited低压梯度系统?一台泵最多可使用4种流动相?泵前预混合?需带在线脱气机低压梯度比例阀数据处理系统数据处理系统ABDC输液泵进样器分析柱柱温箱检测器输液泵进样器分析柱柱温箱检测器脱气机混合器混合器22Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited?采用“HPLC”级溶剂?避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂?对试样有适宜的溶解度?
11、溶剂粘度要小?与检测器相匹配流动相的选择23Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited水的等级水的等级?纯化水?蒸馏水?去离子水因为不纯物的存在,去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物波长(nm)纯化水去离子水吸光率24Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.LimitedHPLC用水可以通过以下几个方法得到:?专门的纯水机或超纯水机:理想的HPLC用水应为18.2 M的超纯水,并通过0.22 m的滤膜,除去热源、有机物、无机离子及空气等。?去离子水重蒸;?二次或三次重蒸水;不管
12、采用何种途径,配制流动相应用新鲜水不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水水的等级25Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited未注入样品时空白梯度的色谱图水中不纯物的出峰水中不纯物的出峰水中的不纯物保留在柱中,随之被乙腈洗脱水中的不纯物保留在柱中,随之被乙腈洗脱水的等级26Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited有机溶剂的等级?HPLC级?优级纯?分析纯都经过蒸馏和0.45 m的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒)优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过0
13、.2 m的过滤,且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱微量分析、梯度洗脱有机溶剂的等级27Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited甲醇乙腈正己烷甲醇乙腈正己烷分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图有机溶剂的等级28Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited1.确定最佳分离状态时的流动相pH2.选择具有与流动相的pH相近的pKa的缓冲液(即使浓度稀也具有较强的缓冲能力)3.确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收(在波长210nm附近进行检测时,不能用醋 酸和柠檬酸的缓冲液)选择
14、缓冲液的步骤29Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited12.327.212.16磷酸6.404.763.13柠檬酸4.87醋酸pK3pK2pK1常用代表性的弱酸的pKa值30Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited?使用前必须过滤?使用后一定要进行清洗,以免造成腐蚀、磨损、阻塞:用纯水冲洗30-60 min(1 ml/min),再用甲醇冲洗30 min?易受到细菌和霉菌的影响不能直接用有机溶剂冲洗缓冲盐溶液缓冲液的使用31Shimadzu International Tra
15、ding(Shanghai)Co.Limited进样器?手动进样器?自动进样器要求:?无残留?扩散小?进样体积可变?可承受高压32Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited手动进样器的原理图进样状态进样状态装填状态装填状态泵柱子泵柱子2316542316544165416533Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited进样体积检测器响应值进样体积检测器响应值定量环体积的一半3倍定量环体积全量注入部分注入进样量和检测器响应的关系示意图进样量和检测器响应的关系示意图34Shimadz
16、u International Trading(Shanghai)Co.Limited?部分注入:部分注入:一般要求进样量最多为定量环体积的一半,如20l的定量环最多进样10l的样品,并且要求每次进样体积准确、相同?全量注入:全量注入:进样量最少为定量环体积的3至5倍,即20l的定量环最少进样60至100l的样品,这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液,达到所要求的精密度及重现性。部分注入和全量注入35Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited交叉污染产生的原因红色表示残留样品36Shimadzu International Tradi
17、ng(Shanghai)Co.Limited手动进样方法一般的方法1.在进样状态下清洗针口2.在装填状态下插入微量注射器3.注入样品4.切到进样状态37Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited便捷的方法(不需清洗)1.进样状态下插入微量注射器2.切到装填状态3.注入样品4.切回到进样状态手动进样方法38Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited自动进样器由计算机自动控制定量阀,按预先编制注射样品的操作程序工作39Shimadzu International Trading(Sh
18、anghai)Co.Limited自动进样器清洗(Rinse):进样针移动到清洗口,针的外壁被清洗液清洗的过程排气(Purge):排除管路中的气泡和更换旧流动相的过程40Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited色谱柱41Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited常用色谱柱?反相C18(ODS)、C8、C4、苯基、TMS、氰基?正相硅胶、氰基、氨基、二醇基?离子交换色谱阳离子交换剂 强阳离子交换剂(SCX)R-SO3-弱阳离子交换剂(WCX)R-COO-阴离子交换剂 强阴离子交换
19、剂(SAX)NR4+弱阴离子交换剂(WAX)DEAE?体积排阻色谱苯乙烯二乙烯基苯共聚物、葡聚糖,琼脂糖,聚丙烯酰胺42Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited分离模式的选择?反相色谱:第一选择?反相离子对色谱/正相色谱:第二选择?特殊:?高分子量化合物:聚合物、蛋白或糖类?无机离子?光学异构体43Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited103非极性高极性中等极性非极性高极性中等极性分子量分子量104105非水相非水相水相正相水相正相反相反相离子交换离子交换离子对反相离子对反
20、相体积排阻体积排阻色谱柱的选择44Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited色谱柱的连接死体积可能会引起分离度变差和重现性变差等问题管线公螺母死体积死体积好的连接差的连接色谱柱45Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited色谱柱的使用新色谱柱使用前:?最好用强溶剂在低流量下(0.2-0.3 mL/min)冲洗 30 min,长时间未用的分析柱也要同样处理?新色谱柱先测柱效,并保留色谱图和实验条件。定期检测柱效46Shimadzu International Trading(Sha
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