液相色谱讲座.pdf
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1、1液相色谱讲座华东理工大学分析测试中心华东理工大学分析测试中心施超欧(施超欧()2007.06.28)2007.06.28一 色谱的由来及发展 1903年3月21日,俄国植物化学家茨维特(Twseet)在华沙的自然科学学会生物学会议上,提出了“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”论文。他首先将植物的石油醚提取物放入装有碳酸钙的玻璃管的上端,然后用石油醚淋洗,结果在玻璃管中不同的色素按吸附顺序呈现出不同的色带。1906年,发表另一篇论文将其色带命名为“色谱”。色谱chromatography(色带的图)色谱的发明人 俄国科学家:M.S.Tswett 正式命名“色谱”的文献 20世纪20年代,
2、许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离,色谱方法才被广泛的应用。自20世纪40年代以来,以Martin(19102002)为首的化学家,建立了一套色谱的基础理论,使色谱的方法从传统的经验方法总结归纳为一种理论方法色谱塔板理论。1938年,Izmailv等发表了薄层色谱法论文。1944年,Consden等发表了纸色谱法论文。1952年,James用气相色谱法分离了低沸点的脂肪酸,奠定了气相色谱的基础,60年代基本成熟。1959年,出现商品化的GPC。1960年后,经stahl等的努力,薄层色谱法得到了广泛的应用。2 但20世纪60年代以来,大量有机化合物相对分子质量大,而且熔点、沸点
3、高,在高温下易分解的物质,用气相色谱作为分析方法已不能满足分析测试的要求。于是,人们重新考虑采用液相色谱,并进一步提高传统的液相色谱的分离效率。因此,液相色谱成为一种分析工具即高效液相色谱(HPLC)。由于高效液相色谱采用紫外可见光度检测,而大多数有机物均有紫外可见吸收,因此HPLC可以对大量有机化合物进行分析。它在有机分析中得到广泛应用,20世纪70年代以后,气相色谱和高效液相色谱,逐步成为各行各业必不可少的分析工具,广泛应用于各个生产领域。随着环境科学的发展,不仅需要对大量有机物质进行分离和检测,而且也要求对大量无机离子进行分离和分析。1975年,美国Dow化学公司的H.Small等人首先
4、提出的离子色谱的概念,在分离柱后加一个抑制柱,同年商品化的离子色谱仪问世。1979年,美国依阿华州立大学J.S.Fritz等人提出的非抑制型离子色谱仪,即采用低交换容量的离子交换树脂制成色谱柱,采用弱酸及其盐类作为淋洗液对不同离子进行淋洗,在控制一定pH值的条件下,背景电导比较低,可以不加抑制器直接电导检测。20世纪80年代以后,一种新型的色谱技术毛细管电泳技术随之出现。毛细管电泳分离效率高、取样量少,与传统的色谱分析相比更为优越,这些优点使毛细管电泳的研究成为色谱技术又一新的热点。20世纪90 年代以后,ELSD一种新型的检测器出现,改变了弱紫外吸收物质的梯度检测难题。20世纪90 年代中期
5、以后,用于HPLC的MS检测器开始普及,使液相进入定性的时代。(APCI,ESI)多维色谱技术的出现为蛋白质基因组学的发展起到了重要的作用。进入21世纪,HPLC在多个方面取得突破:Merck商品化的一体化柱,给人们一种全新的色谱柱概念。2004年,Waters提出了UPLC的新概念,超高压液相色谱。借助小颗粒的填料,特殊化的设计,实现超高效和快速、高通量的分析。2004年10月13日,ESA公司向外界宣布了一项高效液相色谱的最新技术突破,Corona带电气溶胶检测器(CAD)诞生,新一代的通用型检测器。2005年,岛津发布了第一个基于Web的HPLC系统。HPLC向高通量、高灵敏、网络化、小
6、型化发展。二 高效液相色谱基本概念二 高效液相色谱基本概念 什么是高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法,简称:HPLC 是一种区别于经典液相色谱;基于仪器方法的高效能分离手段:高性能的色谱柱,高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器 广泛应用于各个领域:医药/环保/石化/生命科学/食品及农业 在技术,理论及应用上仍处于发展阶段色谱图:HPLC图形结果(Chromatogram)色谱图色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为保留时间。色谱峰保留时间(分)基线 色谱峰保留时间
7、(分)基线峰高峰高峰宽峰宽响应值响应值3液相色谱图相关术语 色谱峰 Peak 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线 峰底 Peak Base 峰的起点与终点之间连接的直线 峰高 Peak Height 峰最大值到峰底的距离 峰宽 Peak Width 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离 半(高)峰宽 Peak Width at Half Height 通过峰高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧相交两点之间的距离液相色谱图相关术语 峰面积 Peak Area 峰与峰底之间的面积,又称响应值 标准偏差;Standard Error 0.607倍峰高处所对应峰宽的一半 拖
8、尾峰 Tailing Peak 后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰 Leading Peak 前沿较后沿平缓的不对称峰 鬼峰 Ghost Peak 并非由试样所产生的峰;亦称假峰液相色谱图相关术语 基线 Baseline 在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号的曲线 基线飘移 Baseline Drift 基线随时间定向的缓慢变化 基线噪声;N Baseline Noise 由各种因素所引起的基线波动 谱带扩展 Band Broadening 由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象液相色谱图相关术语 死时间,t0 Dead time 不被固定相滞留
9、的组分,从进样到出现峰最大值所需的时间 保留时间,tR Retention time 组分从进样到出现峰最大值所需的时间 死体积,V0 Dead volume 不被固定相滞留的组分,从进样到出现峰最大值所需的流动相体积 保留体积,VR Retention volume 组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积评价液相色谱方法的标准问题:什么样的分离结果是好的?分离度?灵敏度?R:分离度tR:保留时间t0:死时间W:峰底宽度色谱分离基本方程色谱分离基本方程)(2121)1()2(WWttRRR+=4不同不同R值的峰重叠情况示意图值的峰重叠情况示意图R1.5可以得到基线分离分离度R反映的是相邻两个
10、峰的分开程度R太小,两个峰无法彻底分离R太大,分离时间过长,工作效率低下一般要求R1.5,也可遵循行业特殊规定+=kknR114根据该公式优化试验条件,提高分离度R。从数学推导来看,分别增大n,k值,都可以提高分离度。色谱分离基本方程色谱分离基本方程分离选择性()对分离度(分离选择性()对分离度(R)的影响)的影响如果t0=1min=1.64/1.58=1.04=1.15/0.85=1.35=0.95/0.63=1.50改变分离选择性改变分离选择性的方法的方法改用不同的流动相改变流动相的组成并非必须大于并非必须大于1.5!改变流动相pH值尽量优化前几种实验条件提高a值,改变柱温避免改变固定相(
11、买新柱子),以便降低成本应用特殊的化学效应改变固定相12RRtt=柱效(柱效(n)对分离度()对分离度(R)的影响)的影响以上两张谱图k,,值完全相同,仅仅由于柱效高低不同使得它们具有不同的分离度。直观的看,峰的尖锐程度代表了柱效高低,峰越尖锐,其柱效越高,通常使用理论塔板数(n)的大小衡量柱效的高低理论塔板数和理论塔板高度的计算方法理论塔板数和理论塔板高度的计算方法理论塔板数理论塔板高度HETP=L/n理论塔板数n越大,柱效越高;理论塔板数HETP越效,柱效越高22/1)(54.5WtnR=容量因子(容量因子(k)对分离度()对分离度(R)的影响)的影响容量因子越大,分离度越大。容量因子越大
12、,分离度越大。k 1 3 5 7 9 11 13 k/k+1 0.50 0.75 0.83 0.88 0.90 0.92 0.93 1.00但当容量因子大于但当容量因子大于10,k/(k+1)的改变不大,而分析时间将大大延长。因此,的改变不大,而分析时间将大大延长。因此,k的最佳范围是的最佳范围是1k20。改变容量因子的方法有:改变容量因子的方法有:改变柱温改变柱温改变柱死体积,其中死体积对改变柱死体积,其中死体积对k/(k+1)的影响很大。的影响很大。改变流动相的配比是最简便、最有效的方法改变流动相的配比是最简便、最有效的方法梯度洗提梯度洗提MRMSttVVKk=容量因子容量因子51 色谱定
13、性分析(1)纯物对照定性各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值,因此保留值可作为定性指标保留值可作为定性指标。三、色谱定性与定量方法实现方法?利用保留时间和保留体积定性?用相对保留值定性?用已知物增加峰高法定性用已知物增加峰高法定性,RsRiRsRisiVVttr=应用范围:适用于简单混合物,对该样品已有了解并具有纯物质的情况。优点:应用简便,不需要其他仪器。缺点:定性结果的可信度不高。?提高可信度的方法:双柱、双体系定性(2)与其它仪器或化学方法联合定性?混合物经色谱分离后,将各组分直接由接口接口导入其它仪器中进行定性。常用的联用方法有:LC-FTIR、LC-MS其它仪器相当于色谱仪的
14、检测器。色谱仪的检测器。?使用范围:复杂样品的定性。?优点:不需要标准物,定性结果可信度高,操作方便。?缺点:需要特殊仪器或设备。2 色谱定量分析(1)色谱定基础色谱定量分析是基于被测物质的量与峰面积成正比色谱定量分析是基于被测物质的量与峰面积成正比。在一定色谱条件下有:.,是峰面积是绝对质量校正因子其中iiiiiAfAfm=6(2)定要解决的问题)定要解决的问题 峰面积的测量和计算 校正因子的测量与计算 色谱定量方法及其应用峰面积的测量与计算 积分仪或色谱工作站积分仪或色谱工作站简便、速度快,精度高,可达0.2-2%,对小峰及不对称峰的结果准确,是色谱发展趋势。手动测量与计算手动测量与计算?
15、峰高乘半峰宽法:适于对称峰?峰高乘峰底宽度法:适于矮宽峰?峰高乘平均峰宽法:适于不对称峰?峰高乘保留值法:适于狭窄峰,快速简便,常用于工厂控制分析。)2(85.015.0YYhA+=2/12065.1YhA=YhA=1.0204RthA=?重叠峰的测量?切线分峰?垂线分峰?连线分峰?计算机拟合分峰校正因子的测量与计算 相对校正因子相对校正因子由于绝对校正因子与仪器的灵敏度有关,又由于灵敏度与实验条件相关,且每一检测器的灵敏度都是不同的,它不容易测量准确,亦无通用性,所以实际工作中使用相对校正因子相对校正因子。7?质量校正因子?摩尔校正因子?相对响应值siismsmimmAmAfff=,isis
16、isMsMiMMmAMmAfff=,1iifS=被测组分的质量被测组分的质量标准物质量标准物质量分子量分子量定量方法 校正归一化法 含归一化 内标法 含内标标准曲线法 外标法 含单点校正?校正归一化法100100100%221121+=+=nniiniiifAfAfAfAmmmmmmC?推导推导:%100%=iiiiiAfAfC?应用范围应用范围:当试样中各组分都能流出色谱柱,且在检测器上均有响应,各组分峰没有重叠时,可用此法。?优点优点:简便、准确,当操作条件如进样量等变化时,对定量结果影响很小,该法适合于常量物质的定量。?缺点缺点:对该法的苛刻要求限制了它的使用。?面积归一化法若各组分的定
17、量校正因子相近或相同,则上式可简化为:%100%=iiiAAC?内标法?推导推导将一定量的纯物质作为内标物,加入到准确称量的试样中。ssiisiAfAfmm=1001001100%,=sississsiiiifmmAAmAfmAfmmC单点校正8?适用范围:适用范围:当只需测定试样中某几个组分,且试样中所有组分不能全部出峰时可用。?优点:优点:受操作条件的影响较小,定量结果较准确,使用上不象归一化法那样受到限制,此法适合于微量物质的分析。?缺点:缺点:每次分析必须准确称量被测物和内标物,不适合于快速分析。?内标标准曲线法(多点校正内标法)fi,sms/m为常数K,此时Ci%=K(Ai/As),
18、以Ci%对Ai/As作标准曲线。优点:不必测校正因子,消除了某些操作条件的影响,方法简便,适合液体试样的常规分析。?外标法(标准曲线法)?用于常规分析用于常规分析?优点:优点:操作简单,计算方便。?缺点:缺点:结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性。该法必须定量进样。?单点校正当被测试样中各组分的浓度变化范围不大时而用单点校正法。即配制一个与被测组分含量十分接近的标准溶液,定量进样,计算被测物的含量。%100%=ssiiCAAC(3)定中的误差问题 样品的代表性(样品的前处理)进样系统的影响 柱系统的影响 测量误差 定量结果的误差分析四 液相色谱仪的基本结构特点及其组成1 液相色谱
19、仪的主要厂家(国外)Waters(,)Agilent(.(cn)Shimadzu(.(cn)Hitachi(www.hitachi-)Alltech(,)Perkin Elmer()Varian()Dionex(.(cn)SSIJascoGilsonBio-rad 9 Waters Alliance UPLC Agilent 1100Shimadzu 2010 Varian 北极星Dionex Summit 液相色谱仪的主要厂家(国内)大连依利特()浙江福立 北分 历元 大连江申 上海伍丰2 液相色谱仪的组成 输液系统 进样系统 分离系统 控温系统 检测系统 样品收集系统 数据处理系统色谱泵进
20、样器检测器数据处理色谱柱2.1 输液系统 流路单泵、双泵、三元泵、四元泵、多泵 压力低压、中压、高压、超高压 控制方式恒流、恒压 流动相等度、梯度 混合方式低压、高压 流量分析泵、半制备泵、制备泵 材质金属泵、非金属泵(peek)液相色谱的溶剂输送系统恒压泵恒流泵气动放大泵注射泵单柱塞泵双柱塞泵隔膜泵并联泵并联泵串联泵串联泵色谱泵色谱泵10不同梯度对系统体积的影响不同梯度对系统体积的影响死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时)滞后(系统)体积滞后(系统)体积溶剂输送系统(泵)检测器进样器色谱柱色谱柱梯度混合器溶剂输送系统(泵)高压梯度注意滞后体积包括进样器、阻尼器、混合器及其管路注意滞后体积包括进样
21、器、阻尼器、混合器及其管路比例阀检测器进样器ABCD色谱柱色谱柱溶剂输送系统(泵)低压梯度 阻尼器 混合器泵运行的一般方式 1 液相色谱一般为金属泵,精度高,耐磨,peek泵一般用于离子色谱(兼容反相,不能用于正相)。2 分析型泵流量在0.01-10.0ml/min,标准为1.0ml/min,不建议在较高的压力下用大流量。3 如果采用比例阀切换流动相、流动相为低压混合,一般需在线脱气才能运行(有多种方式)。最常见的为四元比例阀。单泵、双泵采用高压混合,不易产生气泡。精度比比例阀高,因此目前也有四元高压混合的泵,如SSI、Dionex,可以以二元、四元的方式组合。多元泵(流路)用于组合研究的高档
22、色谱仪。4 HPLC一般运行的压力在几十到几百大气压;压力越低对泵和色谱柱有利。低压色谱一般用于生化分析。Waters最新的UPLC,可以在上千kg/cm2下运行。5 对于简单的样品,多采用等度分析。但对于复杂样品一般采用梯度方式,必须采用二元以上的泵体系。6 一般运行为恒流方式,很少为恒压。7 低压混合一般需在线脱气,否则极易出气泡。高压混合不易出气泡。常见HPLC泵指标 1.流量范围:0.001-9.999mL/min,设定步长0.001 mL/min;2.准确度:2%;3.流量精度:RSD0.3%RSD0.5%;4.压力范围:40MPa(0.001-4.999mL/min),20Mpa(
23、5.000-9.999mL/min);5.压力线性和准确性:6.压力脉动:压力脉动不大于0.2MPa(流量为1ml/min,压力8.5MPa条件下);7.泵密封性:压力为40MPa,时间10min,压降不大于0.5MPa;112.2 进样系统 1 手动高压六通进样阀目前,全世界新的高效液相色谱仪大都选配了Rheodyne公司的高压六通进样阀。除了Rheodyne公司外,Valco公司也生产与销售高压六通进样阀。早期非常有名的进样阀是Waters的U6K可变体积进样器。7725i是目前手动中最常见的一种,有不同规格的进样环,最大可至5ml。进样注射器为平头,不同于气相色谱。2 自动(电动、气动)
24、其阀同手动基本一致。特点是可自动连续进样、可自动调节进样量、进样重复性好、适合大批量样品的分析,而且还可以稀释、添加标准、重复进样、衍生等。手动进样阀取样时,流动相直接进柱,进样口与定量管连接,样品充满定量管后,多余样品从6流出。进样时,泵将流动相压入定量管,将样品全部进入色谱柱分析。自动进样器可以用全自动或半自动的方式进多个样品一般的设计用Rheodyne阀,气阀驱动High-Pressure-Loop Injection PrincipleThe sample is placed under the needleHigh-Pressure-Loop Injection PrincipleT
25、he needle descends through the septum12High-Pressure-Loop Injection PrincipleThe syringe draws in the required volumeHigh-Pressure-Loop Injection PrincipleThe needle retractsHigh-Pressure-Loop Injection Principleand descends to become part of the flow path.2.3 分离系统 色谱柱是HPLC的分离的关键,色谱柱有很多类型。1 柱管玻璃、PEE
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