液相色谱讲座.pdf

1液相色谱讲座华东理工大学分析测试中心华东理工大学分析测试中心施超欧（施超欧（)2007.06.28)2007.06.28一 色谱的由来及发展 1903年3月21日，俄国植物化学家茨维特(Twseet)在华沙的自然科学学会生物学会议上，提出了“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”论文。他首先将植物的石油醚提取物放入装有碳酸钙的玻璃管的上端，然后用石油醚淋洗，结果在玻璃管中不同的色素按吸附顺序呈现出不同的色带。1906年，发表另一篇论文将其色带命名为“色谱”。色谱chromatography（色带的图）色谱的发明人 俄国科学家：M.S.Tswett 正式命名“色谱”的文献 20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛的应用。自20世纪40年代以来，以Martin(19102002)为首的化学家，建立了一套色谱的基础理论，使色谱的方法从传统的经验方法总结归纳为一种理论方法色谱塔板理论。1938年，Izmailv等发表了薄层色谱法论文。1944年，Consden等发表了纸色谱法论文。1952年，James用气相色谱法分离了低沸点的脂肪酸，奠定了气相色谱的基础，60年代基本成熟。1959年，出现商品化的GPC。1960年后，经stahl等的努力，薄层色谱法得到了广泛的应用。2 但20世纪60年代以来，大量有机化合物相对分子质量大，而且熔点、沸点高，在高温下易分解的物质，用气相色谱作为分析方法已不能满足分析测试的要求。于是，人们重新考虑采用液相色谱，并进一步提高传统的液相色谱的分离效率。因此，液相色谱成为一种分析工具即高效液相色谱（HPLC）。由于高效液相色谱采用紫外可见光度检测，而大多数有机物均有紫外可见吸收，因此HPLC可以对大量有机化合物进行分析。它在有机分析中得到广泛应用，20世纪70年代以后，气相色谱和高效液相色谱，逐步成为各行各业必不可少的分析工具，广泛应用于各个生产领域。随着环境科学的发展，不仅需要对大量有机物质进行分离和检测，而且也要求对大量无机离子进行分离和分析。1975年，美国Dow化学公司的H.Small等人首先提出的离子色谱的概念，在分离柱后加一个抑制柱，同年商品化的离子色谱仪问世。1979年，美国依阿华州立大学J.S.Fritz等人提出的非抑制型离子色谱仪，即采用低交换容量的离子交换树脂制成色谱柱，采用弱酸及其盐类作为淋洗液对不同离子进行淋洗，在控制一定pH值的条件下，背景电导比较低，可以不加抑制器直接电导检测。20世纪80年代以后，一种新型的色谱技术毛细管电泳技术随之出现。毛细管电泳分离效率高、取样量少，与传统的色谱分析相比更为优越，这些优点使毛细管电泳的研究成为色谱技术又一新的热点。20世纪90 年代以后，ELSD一种新型的检测器出现，改变了弱紫外吸收物质的梯度检测难题。20世纪90 年代中期以后，用于HPLC的MS检测器开始普及，使液相进入定性的时代。（APCI，ESI）多维色谱技术的出现为蛋白质基因组学的发展起到了重要的作用。进入21世纪，HPLC在多个方面取得突破：Merck商品化的一体化柱，给人们一种全新的色谱柱概念。2004年，Waters提出了UPLC的新概念，超高压液相色谱。借助小颗粒的填料，特殊化的设计，实现超高效和快速、高通量的分析。2004年10月13日，ESA公司向外界宣布了一项高效液相色谱的最新技术突破，Corona带电气溶胶检测器（CAD）诞生，新一代的通用型检测器。2005年，岛津发布了第一个基于Web的HPLC系统。HPLC向高通量、高灵敏、网络化、小型化发展。二 高效液相色谱基本概念二 高效液相色谱基本概念 什么是高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC 是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段：高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器 广泛应用于各个领域：医药/环保/石化/生命科学/食品及农业 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段色谱图：HPLC图形结果（Chromatogram）色谱图色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。色谱峰保留时间（分）基线 色谱峰保留时间（分）基线峰高峰高峰宽峰宽响应值响应值3液相色谱图相关术语 色谱峰 Peak 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线 峰底 Peak Base 峰的起点与终点之间连接的直线 峰高 Peak Height 峰最大值到峰底的距离 峰宽 Peak Width 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离 半（高）峰宽 Peak Width at Half Height 通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离液相色谱图相关术语 峰面积 Peak Area 峰与峰底之间的面积,又称响应值 标准偏差；Standard Error 0.607倍峰高处所对应峰宽的一半 拖尾峰 Tailing Peak 后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰 Leading Peak 前沿较后沿平缓的不对称峰 鬼峰 Ghost Peak 并非由试样所产生的峰；亦称假峰液相色谱图相关术语 基线 Baseline 在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线 基线飘移 Baseline Drift 基线随时间定向的缓慢变化 基线噪声；N Baseline Noise 由各种因素所引起的基线波动 谱带扩展 Band Broadening 由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象液相色谱图相关术语 死时间，t0 Dead time 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间 保留时间，tR Retention time 组分从进样到出现峰最大值所需的时间 死体积，V0 Dead volume 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积 保留体积，VR Retention volume 组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积评价液相色谱方法的标准问题：什么样的分离结果是好的？分离度？灵敏度？R:分离度tR:保留时间t0：死时间W：峰底宽度色谱分离基本方程色谱分离基本方程)(2121)1()2(WWttRRR+=4不同不同R值的峰重叠情况示意图值的峰重叠情况示意图R1.5可以得到基线分离分离度R反映的是相邻两个峰的分开程度R太小，两个峰无法彻底分离R太大，分离时间过长，工作效率低下一般要求R1.5，也可遵循行业特殊规定+=kknR114根据该公式优化试验条件，提高分离度R。从数学推导来看，分别增大n，k值，都可以提高分离度。色谱分离基本方程色谱分离基本方程分离选择性（）对分离度（分离选择性（）对分离度（R）的影响）的影响如果t0=1min=1.64/1.58=1.04=1.15/0.85=1.35=0.95/0.63=1.50改变分离选择性改变分离选择性的方法的方法改用不同的流动相改变流动相的组成并非必须大于并非必须大于1.5！改变流动相pH值尽量优化前几种实验条件提高a值，改变柱温避免改变固定相（买新柱子），以便降低成本应用特殊的化学效应改变固定相12RRtt=柱效（柱效（n）对分离度（）对分离度（R）的影响）的影响以上两张谱图k，,值完全相同，仅仅由于柱效高低不同使得它们具有不同的分离度。直观的看，峰的尖锐程度代表了柱效高低，峰越尖锐，其柱效越高，通常使用理论塔板数（n）的大小衡量柱效的高低理论塔板数和理论塔板高度的计算方法理论塔板数和理论塔板高度的计算方法理论塔板数理论塔板高度HETP=L/n理论塔板数n越大，柱效越高；理论塔板数HETP越效，柱效越高22/1)(54.5WtnR=容量因子（容量因子（k）对分离度（）对分离度（R）的影响）的影响容量因子越大，分离度越大。容量因子越大，分离度越大。k 1 3 5 7 9 11 13 k/k+1 0.50 0.75 0.83 0.88 0.90 0.92 0.93 1.00但当容量因子大于但当容量因子大于10，k/(k+1)的改变不大，而分析时间将大大延长。因此，的改变不大，而分析时间将大大延长。因此，k的最佳范围是的最佳范围是1k20。改变容量因子的方法有：改变容量因子的方法有：改变柱温改变柱温改变柱死体积，其中死体积对改变柱死体积，其中死体积对k/(k+1)的影响很大。的影响很大。改变流动相的配比是最简便、最有效的方法改变流动相的配比是最简便、最有效的方法梯度洗提梯度洗提MRMSttVVKk=容量因子容量因子51 色谱定性分析(1)纯物对照定性各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值，因此保留值可作为定性指标保留值可作为定性指标。三、色谱定性与定量方法实现方法?利用保留时间和保留体积定性?用相对保留值定性?用已知物增加峰高法定性用已知物增加峰高法定性,RsRiRsRisiVVttr=应用范围：适用于简单混合物，对该样品已有了解并具有纯物质的情况。优点：应用简便，不需要其他仪器。缺点：定性结果的可信度不高。?提高可信度的方法：双柱、双体系定性(2)与其它仪器或化学方法联合定性?混合物经色谱分离后，将各组分直接由接口接口导入其它仪器中进行定性。常用的联用方法有：LC-FTIR、LC-MS其它仪器相当于色谱仪的检测器。色谱仪的检测器。?使用范围：复杂样品的定性。?优点：不需要标准物，定性结果可信度高，操作方便。?缺点：需要特殊仪器或设备。2 色谱定量分析(1)色谱定基础色谱定量分析是基于被测物质的量与峰面积成正比色谱定量分析是基于被测物质的量与峰面积成正比。在一定色谱条件下有：.,是峰面积是绝对质量校正因子其中iiiiiAfAfm=6（2）定要解决的问题）定要解决的问题 峰面积的测量和计算 校正因子的测量与计算 色谱定量方法及其应用峰面积的测量与计算 积分仪或色谱工作站积分仪或色谱工作站简便、速度快，精度高，可达0.2-2%，对小峰及不对称峰的结果准确，是色谱发展趋势。手动测量与计算手动测量与计算?峰高乘半峰宽法：适于对称峰?峰高乘峰底宽度法：适于矮宽峰?峰高乘平均峰宽法：适于不对称峰?峰高乘保留值法：适于狭窄峰，快速简便，常用于工厂控制分析。)2(85.015.0YYhA+=2/12065.1YhA=YhA=1.0204RthA=?重叠峰的测量?切线分峰?垂线分峰?连线分峰?计算机拟合分峰校正因子的测量与计算 相对校正因子相对校正因子由于绝对校正因子与仪器的灵敏度有关，又由于灵敏度与实验条件相关，且每一检测器的灵敏度都是不同的，它不容易测量准确，亦无通用性，所以实际工作中使用相对校正因子相对校正因子。7?质量校正因子?摩尔校正因子?相对响应值siismsmimmAmAfff=,isisisMsMiMMmAMmAfff=,1iifS=被测组分的质量被测组分的质量标准物质量标准物质量分子量分子量定量方法 校正归一化法 含归一化 内标法 含内标标准曲线法 外标法 含单点校正?校正归一化法100100100%221121+=+=nniiniiifAfAfAfAmmmmmmC?推导推导：%100%=iiiiiAfAfC?应用范围应用范围：当试样中各组分都能流出色谱柱，且在检测器上均有响应，各组分峰没有重叠时，可用此法。?优点优点：简便、准确，当操作条件如进样量等变化时，对定量结果影响很小，该法适合于常量物质的定量。?缺点缺点：对该法的苛刻要求限制了它的使用。?面积归一化法若各组分的定量校正因子相近或相同，则上式可简化为：%100%=iiiAAC?内标法?推导推导将一定量的纯物质作为内标物，加入到准确称量的试样中。ssiisiAfAfmm=1001001100%,=sississsiiiifmmAAmAfmAfmmC单点校正8?适用范围：适用范围：当只需测定试样中某几个组分，且试样中所有组分不能全部出峰时可用。?优点：优点：受操作条件的影响较小，定量结果较准确，使用上不象归一化法那样受到限制，此法适合于微量物质的分析。?缺点：缺点：每次分析必须准确称量被测物和内标物，不适合于快速分析。?内标标准曲线法（多点校正内标法）fi,sms/m为常数K，此时Ci%=K(Ai/As)，以Ci%对Ai/As作标准曲线。优点：不必测校正因子，消除了某些操作条件的影响，方法简便，适合液体试样的常规分析。?外标法（标准曲线法）?用于常规分析用于常规分析?优点：优点：操作简单，计算方便。?缺点：缺点：结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性。该法必须定量进样。?单点校正当被测试样中各组分的浓度变化范围不大时而用单点校正法。即配制一个与被测组分含量十分接近的标准溶液，定量进样，计算被测物的含量。%100%=ssiiCAAC（3）定中的误差问题 样品的代表性（样品的前处理）进样系统的影响 柱系统的影响 测量误差 定量结果的误差分析四 液相色谱仪的基本结构特点及其组成1 液相色谱仪的主要厂家（国外）Waters(,)Agilent(.(cn)Shimadzu(.(cn)Hitachi(www.hitachi-)Alltech(,)Perkin Elmer()Varian()Dionex(.(cn)SSIJascoGilsonBio-rad 9 Waters Alliance UPLC Agilent 1100Shimadzu 2010 Varian 北极星Dionex Summit 液相色谱仪的主要厂家（国内）大连依利特（)浙江福立 北分 历元 大连江申 上海伍丰2 液相色谱仪的组成 输液系统 进样系统 分离系统 控温系统 检测系统 样品收集系统 数据处理系统色谱泵进样器检测器数据处理色谱柱2.1 输液系统 流路单泵、双泵、三元泵、四元泵、多泵 压力低压、中压、高压、超高压 控制方式恒流、恒压 流动相等度、梯度 混合方式低压、高压 流量分析泵、半制备泵、制备泵 材质金属泵、非金属泵（peek)液相色谱的溶剂输送系统恒压泵恒流泵气动放大泵注射泵单柱塞泵双柱塞泵隔膜泵并联泵并联泵串联泵串联泵色谱泵色谱泵10不同梯度对系统体积的影响不同梯度对系统体积的影响死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时)滞后(系统)体积滞后(系统)体积溶剂输送系统(泵)检测器进样器色谱柱色谱柱梯度混合器溶剂输送系统(泵)高压梯度注意滞后体积包括进样器、阻尼器、混合器及其管路注意滞后体积包括进样器、阻尼器、混合器及其管路比例阀检测器进样器ABCD色谱柱色谱柱溶剂输送系统(泵)低压梯度 阻尼器 混合器泵运行的一般方式 1 液相色谱一般为金属泵，精度高，耐磨，peek泵一般用于离子色谱（兼容反相，不能用于正相）。2 分析型泵流量在0.01-10.0ml/min，标准为1.0ml/min，不建议在较高的压力下用大流量。3 如果采用比例阀切换流动相、流动相为低压混合，一般需在线脱气才能运行（有多种方式）。最常见的为四元比例阀。单泵、双泵采用高压混合，不易产生气泡。精度比比例阀高，因此目前也有四元高压混合的泵，如SSI、Dionex，可以以二元、四元的方式组合。多元泵（流路）用于组合研究的高档色谱仪。4 HPLC一般运行的压力在几十到几百大气压；压力越低对泵和色谱柱有利。低压色谱一般用于生化分析。Waters最新的UPLC，可以在上千kg/cm2下运行。5 对于简单的样品，多采用等度分析。但对于复杂样品一般采用梯度方式，必须采用二元以上的泵体系。6 一般运行为恒流方式，很少为恒压。7 低压混合一般需在线脱气，否则极易出气泡。高压混合不易出气泡。常见HPLC泵指标 1.流量范围：0.001-9.999mL/min,设定步长0.001 mL/min；2.准确度：2%；3.流量精度：RSD0.3%RSD0.5%；4.压力范围：40MPa(0.001-4.999mL/min)，20Mpa(5.000-9.999mL/min)；5.压力线性和准确性：6.压力脉动：压力脉动不大于0.2MPa(流量为1ml/min，压力8.5MPa条件下)；7.泵密封性：压力为40MPa，时间10min，压降不大于0.5MPa；112.2 进样系统 1 手动高压六通进样阀目前，全世界新的高效液相色谱仪大都选配了Rheodyne公司的高压六通进样阀。除了Rheodyne公司外，Valco公司也生产与销售高压六通进样阀。早期非常有名的进样阀是Waters的U6K可变体积进样器。7725i是目前手动中最常见的一种，有不同规格的进样环，最大可至5ml。进样注射器为平头，不同于气相色谱。2 自动（电动、气动）其阀同手动基本一致。特点是可自动连续进样、可自动调节进样量、进样重复性好、适合大批量样品的分析，而且还可以稀释、添加标准、重复进样、衍生等。手动进样阀取样时，流动相直接进柱，进样口与定量管连接，样品充满定量管后，多余样品从6流出。进样时，泵将流动相压入定量管，将样品全部进入色谱柱分析。自动进样器可以用全自动或半自动的方式进多个样品一般的设计用Rheodyne阀，气阀驱动High-Pressure-Loop Injection PrincipleThe sample is placed under the needleHigh-Pressure-Loop Injection PrincipleThe needle descends through the septum12High-Pressure-Loop Injection PrincipleThe syringe draws in the required volumeHigh-Pressure-Loop Injection PrincipleThe needle retractsHigh-Pressure-Loop Injection Principleand descends to become part of the flow path.2.3 分离系统 色谱柱是HPLC的分离的关键，色谱柱有很多类型。1 柱管玻璃、PEEK、不锈钢玻璃柱低压分离，填料自己填装，常用于生化；或早期的柱子；离子色谱也有这种规格。PEEK主要用于离子色谱柱。不锈钢大多采用这种类型，耐压，不宜变形。2 类型保护柱、分离柱、卡套柱等。保护柱加在分离柱前、与分离柱类型相同。卡套柱MERCK出的一种柱子，成本比较低。3 规格大小LC-MS柱、常规分析柱、制备柱等LC-MS柱细口径(2.1、3.2mm)、填料颗粒细(3.5um或更细)、长度短(5-10cm)、流量小(0.1-0.5ml/min)常规分析柱口径在3.9-7.8mm(3.9、4.0、4.6、5、7.8等)、填料颗粒在5-15um、长度10-30cm、流量在1.0-5.0ml/min，使用最普遍。制备柱孔径大10mm到几百厘米，填料颗粒在5-50um或更粗，长度几十厘米到几米或更高、流量从十几ml/min到几百升/min甚至更高。4 填料金属氧化物(Al2O3等)、硅胶（SiO2）、聚合物（聚合的苯乙烯二乙烯苯等）、杂交柱（Xettra）、整体化柱（chromolith）。5 分离类型正相、反相、离子交换、离子排斥、亲和、排阻等。13色谱柱的保护保护柱防止流动相及样品中杂质对色谱柱的损害。可换芯式保护柱色谱柱的保护1）柱压低于150kgf/cm22）柱温在40左右，最高使用温度为503）缓冲液PH使用范围为27ODS柱的使用注意点：*硅胶在PH为34时稳定性最好*碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。色谱柱标签的识别LichroCART 250-4 Purospher STAR RP-18e(5 um)RR R RRHibarRHithunter柱子类型1 传统柱（不需卡套）2 卡套柱（需卡套）3 半制备柱123 柱长(mm)柱内径(mm)粒径端基封尾十八烷基硅烷键合填料类型填料名称 其Hibar、LichroCART、Hithunter表示柱子的类型，但大多数色谱柱厂家一般没有单独这样标识，用其它表示来代替。250-4表示柱子的长度为250mm、内径为4mm，是色谱柱的主要参数，每根色谱柱上都有。PurspherSTAR表示填料的品牌，一般专业色谱柱厂家有很多不同名称的品牌。RP-18e表示填料的类型为反相的C18，末端封尾，不同类型的填料有不同的表示方法，是色谱柱的重要参数；有的厂家为区别封尾和不封尾的柱子加上e或其它标识来区别，但新型的色谱柱多为封尾，不加其它标识。（5m）表示填料颗粒的大小，填料还有一个重要参数是孔径，分析柱在60-120之间，而蛋白质分析的硅胶柱多为300。在一些色谱柱的标识中，这二个参数常常与柱子填料的类型混在一起表示，如5C18表示颗粒为5m的C18柱。Si60 表示孔径为60的硅胶柱。有些色谱柱上还有一些数字，如批号、货号、柱子编号等可以查询到色谱柱的出厂日期等，但用处并不是很大。在色谱柱上有时还有厂家地址，名称等。每根色谱柱都有流动相流向的标志，如果没有明显的方向标志，则流动相的流向从左向右，沿着文字的阅读方向。色谱柱上最主要几个标识是填料名称、填料类型、柱子规格。14常见色谱柱的类型 专业的液相色谱仪厂家都有色谱柱生产，除此外还有很多专业的色谱柱厂家。C18又称ODS柱，使用最普遍、规格多，适合大多数化合物的分析，市场上品种繁多，值得注意的是同样的C18柱，得到的结果可能非常不一致，尤其是极性或离子化合物。流动相为甲醇（乙腈）水系统。C8类同于C18柱，保留能力比C18差。C4，C2，C1反相，用于一些特定的化合物分析，寿命较短。NH2既能用于反相又可用于正相，常用于小分子的糖分析。C6H5苯基柱，适合芳香族化合物的分离。CN既能用于反相又可用于正相，用于某些杂环化合物的分离。OH二醇基柱，一般用于正相分离，保留能力比Si强。Si硅胶柱，典型的正相柱，适合非极性化合物的分离，流动相多为非极性的溶剂。SAX强碱性阴离子交换柱，硅胶基质，pH在3-7.5，用于阴离子化合物的分离，如苯(萘)磺酸类、羧酸类。SCX强酸性阴离子交换柱，硅胶基质，用于阳离子化合物的分离，如嘌呤、嘧啶类。WAX弱碱性阴离子交换柱，硅胶基质，用于特定的化合物或生化分析。WCX强酸性阴离子交换柱，硅胶基质，用于特定的化合物或生化分析。氨基酸柱专门用于氨基酸分析的C18柱。其它特定的反相柱如C16、紫杉醇柱等。离子交换柱聚合物基质，一般为苯乙烯二乙烯苯聚合的柱子，pH范围在0-14，适合在强酸强碱条件下分析，但柱效低于C18柱。而且价格高。离子色谱柱大多数为离子交换柱；聚合物柱子对蛋白不易变性，常用于生化分析蛋白质等。离子排斥柱聚合物基质，一般为苯乙烯二乙烯苯聚合的柱子，pH范围在0-14，如有机酸柱。手性柱用于特定的手性化合物的分类，多为正相，适用范围窄，专一性强。Hilic柱反反相色谱柱 大多数反相的色谱柱填料在60-120，分析的分子量小于2000，300 以上分析蛋白等大分子。常见的色谱柱品牌 目前国内用的较多品牌的有 Zorbax、Symmetry、LiChrosorb、Bondpak、Nova-Pak、Partisil、Ultrasphere、Resolve、Xettra、kromasil、Diamonsil、Lichrospher、shim-pack、chromotith、luna、PurspherSTAR、cosmosil2.4 控温系统 控温系统大多数并不是HPLC的必须备件，凝胶系统一般是要求控温的，采用示差检测最好配置控温箱，离子色谱也同样。有些仪器除了加热的控温系统外，还自带低温冰箱。液相色谱常规分析的柱温在20-60度。不同温度对样品的保留时间有很大的影响。柱温箱：分析结果重现性好 提高柱效 降低柱压 保证检测稳定性柱温控制的优点：152.5 检测系统 检测器类型多，有很多分类方法：通用型检测器 示差折光型检测器，电容检测器，蒸发光检测器等 选择型检测器 紫外-可见波长检测器，荧光检测器，电化学检测器等HPLC检测器基本要求和特点 灵敏度高（10-6g）、线性范围宽、通用 响应快、响应值不受温度及流动相影响 噪音低、漂移小 死体积小，以保持高的分离效能 对样品无破坏性 定性定量信息 稳定、可靠、重现性好 方便，便宜 目前没有一种检测器能满足上述要求检测器评价的几个参数 1 噪声噪声没有溶质通过检测器时，检测器输出的信号变化，分为短噪声和长噪声。2 漂移基线随时间的增加朝单一方向的偏离。3 灵敏度一定量的物质通过检测器时所给的信号大小。4 检测限响应值为2(3)倍噪音时所需的样品量-信噪比。5 线形范围检测信号与被测物质量呈线形的范围。6 最小检测量和最低检测浓度产生的信号等于2(3)倍噪音时的进样量。检测器的种类996电化学电化学示差折光电化学脉冲安培荧光电导固定波长紫外光电二极管矩阵可调波长紫外/可见可编程紫外/可见示差折光电化学脉冲安培荧光电导固定波长紫外光电二极管矩阵可调波长紫外/可见可编程紫外/可见其他放射性、质谱 热能、LALLS 蒸发质量、粘度其他放射性、质谱 热能、LALLS 蒸发质量、粘度1 紫外可见检测器（UV-VIS）紫外检测器有很多类型，早期的单紫外（254nm），以及插片式的固定多波长。目前一般大多采用多波长的紫外可见检测器，检测波长在190nm900nm。紫外区采用氘灯、可见区采用钨灯。目前最多见到可以同时设定4个波长检测，并有停泵扫描功能。2 光电二极管阵列检测器 1975年首次报道了光电二极管阵列检测器。1982年，HP公司推出了第一个SH商品化的HP1040A。简称PDA、PDAD、DAD等 可同时得到多个波长的色谱图 可计算得到最大吸收波长 可以得到时间-波长-吸收值为坐标的三维图形 可以对峰进行纯度检验和紫外定性。163 荧光检测器 灵敏度极高 选择性好 线性范围宽 外界条件及流动相影响小 应用范围窄 背景荧光和淬灭荧光等干扰 激发波长发射波长4 示差检测器 目前最常用的通用型检测器。总体性能检测器 浓度敏感性检测器中等灵敏度 对压力和温度的变化很敏感流动相流速影响检测信号（流通池的几何形状、大小及材料、检测器的光路系统）5 电化学检测器 测量溶液整体性质（通用性强）电导检测器和电容检测器 测量溶质组分性质（灵敏度和选择性好）安培、极谱、库仑、电位检测器5.1 安培检测器 优点 灵敏度高、选择性好、线性范围宽 结构简单、检测池体积小 局限性 流动相必须有导电性 信号随流动相流速、温度、pH值等变化敏感 流动相中氧干扰 电极寿命可分为直流安培、脉冲安培、积分安培5.2 电导检测器 离子色谱法最主要检测器 测定多种阴阳离子的灵敏检测器 检测信号是离子电导与流动相电导之差、负值.抑制柱降低本底电导.温度对信号的影响比较大可分为抑制电导和非抑制电导二种类型17 5.3 库仑检测器库仑阵列检测器 5.4 电势检测器 5.5 极谱检测器 5.6 介电常数检测器6 蒸发光散射检测器 是90年代开始在全国普及，作为新一代通用检测器的逐步替代示差检测器。优点：通用型质量检测器 灵敏度高于RI 可以进行梯度洗脱 可作为SEC和SFC色谱/细内径LC检测器 可测定磷脂、皂甙、糖类、聚合物、树脂 限制：受样品组分和流动相的挥发性的影响，不能完全替代示差检测器7 质谱检测器 70年代末出现最早的质谱检测器，80年代后期电喷雾技术的发展LC-MS技术开始成熟。1992年，ESI（大气压电喷雾）1993年，APCI技术的出现（大气压化学电离）为小及中等分子量有机物，药物及代谢物分析提供了帮助。目前质谱检测器应用越来越多。LC-MS：结合HPLC对复杂基体化合物的高分离能力与MS的独特选择性、灵敏度、分子量及结构信息与一体 困难在于LC-MS压力匹配问题、流量匹配问题、难挥发溶剂的排除问题Molecular WeightNon-PolarPolarEI/CIElectrosprayAPCI100,0001000离子化的模式?LC-MS能够提供的质谱信息 化合物分子量（误差0.001%）未知化合物碎片结构 信息 可用于无共价键、无官能团化合物的检测完整谱图和多重扫描方式分析谱图：色谱图、总离子流色谱图、质谱图、质量碎片图谱、质量色谱图2.6 样品收集系统 作为分析型的HPLC一般没有制备系统，如果制备MG级的样品还是可以的。但如果制备几十MG，一般分析柱是难以承受了，必须要大口径的色谱柱，大的进样体积及大的流量。制备克级的样品需用专门的制备色谱仪。专门的样品自动收集系统以及溶剂回收系统。18不同制备规模的色谱柱不同制备规模的色谱柱生产规模制备色谱柱直径生产规模制备色谱柱直径100-800mm中试规模制备色谱柱直径中试规模制备色谱柱直径50-150mm小量制备，色谱柱直径小量制备，色谱柱直径10-40mm2.7 数据处理系统 早期采用记录仪，面积采用重量法来测定，准确度差，结果不能长期保存。数据处理机将数据处理功能固化到硬件上，准确度大大提高，但修改参数麻烦，不能长时间保存图谱。早期的计算机采用各自的专用操作系统和软件，系统价格贵、不通用。近十年来，随着计算机运行速度的大大提高以及PC的大量应用，目前数据采集和处理完全可用普通微机代替，无需早期的专用计算机。不同色谱仪的数据结果也有行业标准，如AIA、CSV等格式或采用TXT格式对二维数据处理。有的色谱工作站可以兼容其它公司的仪器，并进行控制。目前也有通用的色谱工作站，采用标准的接口方式，（带TTL等）。长图记录仪色谱数据处理机色谱数据工作站五 液相色谱仪的日常维护及保养仪器保养的目的及基本要素 1 保持色谱仪运行正常,时常注意仪器运行状态，有状况及时排除。2 及时详细记录各种现象，有案可查。3 避免带病运行，以防缩短仪器寿命。4 主要是泵、色谱柱、管路等的维护。5 定期有计划地进行仪器保养维护、以延长消耗品的寿命。19HPLC的日常操作条件：温度：1030；相对湿度3kgf/cm2，则堵塞。2.4 混合器不同仪器混合器的位置和结构都不一样故障：堵塞现象：系统压力波动大或压力偏高，基线不稳，拆开后接头处有白色颗粒或有黑色污染物。措施：5稀硝酸，超声波清洗。判断依据：关闭排液阀，断开出口管路，设定流速1mL/min，如压力3kgf/cm2，则堵塞，判断基本同流路过滤器。2.5 管路 现象：管路杜塞比较容易发现，造成系统压力不稳，尤其含盐流动相切换时，速度过快将造成盐析出，杜在管路的接头处。其次是含颗粒样品进样后造成管路杜塞。措施：断开连接管路，确定杜塞位置，拆下管路，加稀酸，超声波清洗。或者反接管路冲洗 如果杜在管路中间，则可能报废。HPLC常用连接管3 进样系统的维护手动进样器手动进样器定子转子针头密封垫弹簧不锈钢套22操作注意点：操作注意点：1）插针应插到底2）不使用时将针头留在进样器内3）进样应使用液相色谱专用平头进样针，有些国产进样针针头较细，易引起残留。清洗：清洗：4）样品分析后应及时清洗，防止样品对下次分析的残留，清洗应使用专用针口清洗器。5）每次分析前应清洗进样针，如有针尾的黑色污垢，可用碱(表面活性剂)清洗，再用水洗。4 检测系统的维护紫外检测器紫外检测器参比池样品池光线硅光电池板（1）紫外检测器（1）紫外检测器故障：样品池受污表现：样品池和参比池能量相差较大，基线不稳检查方法：设定250nm波长，通甲醇或水，查看SMPL EN和 REF EN，如两者相差较大，则样品池受污。（对于岛津仪器）措施：用针筒注入异丙醇，清洗样品池；如污染严重，拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中超声波清洗。（2）氘灯更换氘灯更换氘灯（紫外检测器）判断氘灯能量：设定220nm波长，检查参比池能量，如能量低于800，需更换氘灯。（岛津仪器）一般仪器上有灯使用的时间，可以参考。目前由于计算机发展快，基本上使用色谱工作站，但有少数的数据处理机。仪器的计算机最好专用，加装防毒系统，并及时升级。5 数据处理系统六 高效液相色谱仪器故障的诊断与维修引自色谱通讯2005色谱年会特刊23压力篇更换或维修压力传感器失灵或表坏压力表没有反应拧紧色谱柱或保护柱没接好色谱柱或保护柱色谱柱接口漏液更换或清洗吸滤头吸滤头严重堵塞，抽不动排气空气进入泵头无液体流出拧紧泵清洗管路泵清洗管路没关拧紧泵头螺丝接口太松泵头漏液插紧电源接头电源接头松脱压力无检查电源电源不通面版灯不亮故障排除判断现象更换或维修压力传感器失灵或指针没有调零其它清洗检测池检测器池子阻塞正确旋转进样阀旋转不到位冲洗进样器，必要时拆洗进样阀系统阻塞冲洗，必要时更换连接管路阻塞清洗或更换流路过滤系统阻塞不接柱子压力高冲洗，更换流动相缓冲结晶盐沉淀流动相有沉淀换柱色谱柱或保护柱柱压太高升高温度柱温太低稀释或改变流动相样品与流动相不互溶使用恰当的流动相流动相不互溶校正后并维修泵流速设定不准，偏高接柱子压力高压力高更换垫片进样阀密封垫磨损漏液其它拧紧接头管路接头与柱没有拧紧检查漏液位置并维修泵系统漏液降低柱温柱温过高更换恰当的色谱柱色谱柱漏穿失效校正后维修泵流量不准，偏低接柱子压力低压力低更换或维修压力传感器不稳定或指针有问题超声清洗或更换管路流动不畅，有盐析出清洗检测池检测器池子不畅，有颗粒反冲或拆开清洗进样阀内有异物反冲或拆开色谱柱清洗筛板色谱柱(保护柱)进口有异物压力变化无规律修理或更换单向阀泵单向阀密封不严重新安装或换单向阀泵单向阀宝石球卡壳泵内有声音拧紧接口连接口太松漏液清洗或更换混合器溶剂混合器故障压力波动排气泡，溶剂需脱气溶剂脱气不适当，或流动相走空泵或系统内有气泡所引起的压力是正常采用梯度压力变化重现压力不稳色谱峰篇现象判断故障排除前沿峰柱头出现空洞更换色谱柱保护柱失效换柱芯进样体积太大或样品浓度太高，在反相中，样品溶剂极性大大超过流动相降低进样体积或降低样品浓度拖尾峰柱性能下降更换色谱柱保护柱失效换柱芯色谱柱或保护柱被污染清洗柱或保护柱，必要时更换色谱柱选择不当选择恰当的色谱柱流动相选择不当选择恰当的流动相比例样品过载减少进样浓度或体积流动相没平衡平衡后再进样泵流量不稳定维修或更换进样系统有死角维修或更换温度过低或过高控制合适的温度24维修或更换泵流量不稳定平衡后再进样流动相没平衡更换合适的管路连接管路孔径不匹配检查系统，更换或缩短管路等系统死体积太大（如管路太长等）使用柱温箱，控制合适的温度温度过低或过高检查进样器进样器问题使用较小的时间常数检测器时间常数太大检查漏液位置并维修漏液改变检测器参数或更换检测器样品过量，但响应很低选择其它色谱条件以改善分离效果出现两个或多个未被完全分离的物质峰调节流速流动相流速太低选择恰当的流动相流动相选择不当（如缓冲液浓度过低）选择恰当的色谱柱色谱柱选择不当清洗柱或保护柱，必要时更换色谱柱或保护柱被污染换柱芯保护柱失效更换色谱柱柱性能下降宽峰使用较大的时间常数检测器时间常数太小改变分析体系，抑制互变特殊样品，存在异构互变现象使用柱温箱，控制合适的温度温度过低或过高改变pH流动相pH选择不当平衡后再进样流动相没平衡改变流动相或添加改性剂流动相选择不当不设置参比波长试试紫外检测器参比波长设置不对改变溶剂或采用流动相溶解样品样品溶剂不溶于流动相降低进样体积或降低样品浓度进样体积太大或样品浓度太高清洗柱或保护柱，必要时更换色谱柱或保护柱被污染换柱芯保护柱失效更换色谱柱柱性能下降裂峰改变流动相比例和组成或换柱子流动相比例不对，留在柱子中转到Load手动进样注射位置不对（在inject档）重新连接进样器管路连接错误检查样品配制过程，更换样品样品降解加样品无样品检查进样器自动进样器故障检查并正确链接检测器与数据处理装置链接故障选择其它类型检测器检测器类型选择错误设置正确的检测器参数检测器参数设置错误无峰故障排除判断现象负峰（全部）连接数据处理系统信号线接反正确连接记录仪或检测器信号极性相反改变极性设置检测器参数设置有问题改变参数流动相本底极高检查流动相组成负峰（出现一个或几个峰）离子对分离体系对峰的影响在流动相中溶解样品样品中存在比流动相背景吸收低的物质改变流动相组成或检测器参数使用的流动相本底吸收高使用流动相稀释样品进样系统峰不影响结果稳定后进样流动相变换换纯度更高的