免疫学常用实验方法.pptx
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1、Ag-Ab reation:ELISA,Immunohistochemistry,FACS,Westernblot,Hybridoma&monoclonalantibodyCell function:proliferation3HTdRMTTCFSECytotoxicity51CrAnimal experiment非共价键结合I.Antigen-Antibody Reaction 抗体的互补决定区抗体的互补决定区(CDRs)抗原决定簇抗原决定簇(antigenic determinant)又称表位又称表位(epitope)非共价键结合非共价键结合CDR1CDR2CDR3CDR1CDR2CDR3
2、CDR:Complementarity Determining RegionFR:Framework Region FR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4HLComplementarity-determining regions(CDRs):Antigenic DeterminantSpecificity 特异性 Features of Ag-Ab Reaction Reversibility可逆性 Ag+AbAgAb解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。在一定条件下在一定条件下(如低如低pH、高浓度盐等、高浓度盐等)可以解离。可以解
3、离。RatioRatio最适比例最适比例Sensitivity Sensitivity 敏感性敏感性化学比色法:化学比色法:mg/ml mg/ml 酶反应测定法:酶反应测定法:5-10g/ml 5-10g/ml(免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿)标记的免疫测定法标记的免疫测定法:ng/ml ng/ml 水平水平(例如,用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定例如,用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定HBsAgHBsAg,其,其敏感度可达敏感度可达0.1ng/ml)0.1ng/ml)ELISA-酶联免疫吸附试验Immunohistoch
4、emistry-免疫组织化学FACS-流式细胞术WesternBlotting-免疫印迹技术Often used methods1.ELISA(酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)RIA(radioimmunoassay,Berson&Yalow,1960)IRMA(immunoradiovelricassay,Miles&Hiles,1968)E(L)I(S)A(Engvall&Perlmann,vanWeemenandSchuurs,1971)Copyright2005AmericanAssociationforClinica
5、lChemistryLequin,R.M.Clin Chem 2005;51:2415-2418Estimates of the number of articles published per 5-year period from 1960 to 2005Figure.Estimatesofthenumberofarticlespublishedper5-yearperiodfrom1960to2005.ThesearchwasdoneinFebruary2005inPubMed/NationalLibraryofMedicine,NIH,withthesearchterms:enzyme-
6、immunoassay,enzyme-linkedimmunosorbentassay(EIA/ELISAcombined),andRIA.(Ordinate),numberofarticlesinwhichthekeywordsarequoted.(Abscissa),5-yearperiodsfrom1960to2005.,combinedEIA/ELISA;,RIA.Note:Idonotpretendthatthenumbersinthisfigureareprecise;thetrends,however,areevident.基础基础:抗原或抗体的固相化 抗原或抗体的酶标记用途:用
7、途:目标蛋白的定性或定量分析 三个必要试剂三个必要试剂:(1)固相的抗原或抗体,即免疫吸附剂(immunosorbent);(2)酶标记的抗原或抗体,称为结合物(conjugate);(3)酶反应的底物。ELISAa.包被b.抗原抗体反应c.酶促反应,显色d.终止显色,读取数据。ELISAELISA基本的实验过程基本的实验过程对照和标准曲线对照和标准曲线阳性对照阴性对照定量测定:标准品制作标准曲线 待测样品的合理稀释不同类型的检测方法不同类型的检测方法2.Immunohistochemistry(免疫组化免疫组化)原理:原理:抗原抗体反应,抗体标记技术(荧光、酶)用途:用途:组织或细胞内抗原的
8、定性和定位流程:流程:Copyright2007AmericanAssociationforCancerResearchZhao,X.et al.Cancer Res 2007;67:4443-4450Figure 3.mTNFinducesinfiltrationofinnateimmunecellsandangiostasisintumorsfromTNFR1/butnotTNFR1/R2/mice.AtoF,TNFR1/miceorTNFR1/R2/micewereinjecteds.c.with5x106ofJ-mTNF10cells.Tendaysaftertumorcellchal
9、lenge,tissuesectionsoftheinjectionsitewerestainedforMac-1+(AandB),Gr-1+(CandD),andCD31+(EandF)cellsasindicated.GandH,forconfocalmicroscopyanalysis,tissuesectionswerestainedwithCy3-labeledanti-CD31forbloodvesselendothelialcells(green)andtheVasoTACSin situkittodetectapoptosis(red).Arrows,apoptoticendo
10、thelialcellsinthetumor.成败的关键因素成败的关键因素:组织的固定、包埋 抗体(特异性、浓度、孵育温度和时间)非特异性抗原的封闭 内源性酶或自发荧光的消减 显色思考:为什么有的抗体能用于冰冻切片却不能用于石蜡切片?思考:为什么有的抗体能用于冰冻切片却不能用于石蜡切片?3.Flow Cytometric analysis(流式细胞术流式细胞术)FACS:(Fluorescence-Activated Cell Sorter)BDFACSVantageBD-Calibur测量对象测量对象 大小 悬浮在溶液中的相互离散颗粒 大小范围:0.2m-300 m 高等真核细胞 类型 酵母
11、 细胞类型 细菌 多细胞的聚集体,如胰岛等。细胞核 非生命颗粒 染色体 其它细胞器以及乳化微球等。细胞表型分析胞内细胞因子的检测细胞周期和DNA倍体分析细胞分选主要用途主要用途(1)多参数定量分析每一个细胞;(2)细胞分选;高纯度:99%以上;可分析小于1/10000比例的稀有细胞群、单细胞克隆等。(3)高通量(分析分选)分析150,000个/秒 分选100,000个/秒 特点特点 基本结构基本结构工作原理工作原理二色镜1 2 3带通滤波片光电倍增管激光束细胞收集透镜前向散射光侧向散射光,荧光a.光信号收集分离,导向,各探测通道接收并转化为电信号。FSC SSC FL1 FL2 FL3对数对数
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