测定胰岛素一级结构的方案.docx
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1、测定胰岛素一级结构的方案122020年4月19日文档仅供参考标题:测定胰岛素一级结构的方案姓名:学号:院系:专业:提交时间: 11月19日星期一摘要:研究蛋白质结构与功能关系是当前分子生物学的重大课题之一,1953年,英国生物化学家Fred Sanger报道了胰岛素(insulin)的一级结构,同年,Watson与Crick发现DNA的双螺旋结构。1969年,基本与应用化学联合会规定以各种氨基酸按一定顺序排列构成的蛋白质肽链骨架为蛋白质基本结构。测定蛋白质(胰岛素)结构,主要要测定出:多肽链的数目;每条多肽链末端氨基酸的种类;每条肽链上氨基酸的种类,数目及连接顺序;链内于连间二硫键的数目与位置
2、。至此,一种蛋白质的结构已基本明确。关键字:胰岛素 一级结构 测定方法 化学法与酶解法1953年,英国生物化学家Fred Sanger报道了胰岛素(insulin)的一级结构,这是世界上第一个被确定一级结构的蛋白质。同年,Watson与Crick发现DNA的双螺旋结构。生物化学由此迈向了一个更高层次分子生物学时代。 胰岛素的一级结构由51个氨基酸残基组成分两条链:A链:21个氨基酸残基B链:30个氨基酸残基含三个二硫链:一个A链内的二硫两个链间二硫键 胰岛素的功能:胰岛素是由胰岛细胞分泌的一种蛋白质类激素促进肌肉、脂肪组织细胞膜对葡萄糖的通透性 诱导、促进肝脏葡萄糖激酶等合成,增强糖的分解代谢
3、 促进肝、肌肉中糖原合成 抑制糖异生 促进糖转变为脂肪 抑制脂肪分解 人与各种动物胰岛素一级结构比较表:一些哺乳动物胰岛素一级结构的差异名 称A8A9A10B30与人的差异数活性人苏氨酸丝氨酸异亮氨酸苏氨酸-猪-丙氨酸1抹香鲸-丙氨酸1马-甘氨酸丙氨酸2象-甘氨酸缬氨酸2牛丙氨酸-缬氨酸丙氨酸3蛋白质分子的一级结构测定,概括起来包含多肽链的分离、降解、肽段的分离和顺序分析以及SS定位等。1.多肽链的分离在测定一个蛋白质的结构以前,首先必须保证被测蛋白质的纯度,使结果准确可靠。其次要了解它的分子量和亚基数,按照其亚基数将蛋白质分成几个多肽链。1)肽链的拆开胰岛素分子多肽链的连接有共价结合和非共价
4、结合两种。要拆开以共价结合的-S-S-连接的多肽链,采用的方法:巯基乙醇还原: 利用还原剂巯基乙醇亦可使蛋白质的-S-S-断裂。当高浓度的巯基乙醇在pH8条件下室温保温几小时后,能够使-S-S-定量还原为桽H。与此同时反应系统中还需要有8摩尔脲或6摩尔盐酸胍使蛋白质变性,多肽链松散成为无规则的构型,此时还原剂就可作用于-S-S-。此反应是可逆的,因此要使反应完全,疏基乙醇的浓度必须在0.1-0.5摩尔。2)末端分析(1)N-末端测定:二甲基氨基萘磺酰氯法: 1956年Hartley等报告了一种测定N-末端的灵敏方法,采用1-二甲基氨基萘-5-磺酰氯,简称丹磺酰氯。它与游离氨基末端作用,方法类似
5、于Sanger的DNFB法(二硝基氟苯法(FDNB,DNFB):1945年Sanger提出此方法,是她的重要贡献之一。DNP-氨基酸用有机溶剂抽提后,经过层析位置可鉴定它是何种氨基酸。Sanger用此方法测定了胰岛素的N末端分别为甘氨酸及苯丙氨酸。),产物是磺酰胺衍生物。丹磺酰链酸具有强烈的黄色荧光。此法优点为灵敏性较高(比FDNB法提高100倍,样品量小于1毫微克分子)及丹磺酰氨基酸稳定性较高(对酸水解稳定性较DNP氨基酸高),可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定。(2)C-末端分析:肼解法: 这是测定C-末端最常见的方法。将多肽溶于无水肼中,100下进行反应,结果羧基末端氨基酸以游离氨基酸状释放
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