RNA提取常见问题.pptx
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1、q异硫氰酸胍异硫氰酸胍/苯酚法苯酚法 步骤步骤:材料准备:材料准备:尽量新鲜。尽量新鲜。裂解变性裂解变性:异硫氰酸胍异硫氰酸胍(亚硫氢胍,巯基乙醇,亚硫氢胍,巯基乙醇,N-N-月桂肌氨酸等)。月桂肌氨酸等)。使细胞及核蛋白复合物变性,释放使细胞及核蛋白复合物变性,释放RNARNA,有效抑制核酸酶。,有效抑制核酸酶。纯化分离:纯化分离:苯酚,氯仿,异戊醇。苯酚苯酚,氯仿,异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。氯仿可抽提去除杂物。洗涤:洗涤:7070乙醇。乙醇。沉淀:沉淀:异丙醇、无水乙醇。异丙醇、无水乙醇。乙酸钠(乙酸钠(pH4.0pH4.0):维持变性的细胞裂解液的):维持变性的细胞裂解液的pHp
2、H值,沉淀值,沉淀RNARNA。此外还常用氯化锂选择沉淀此外还常用氯化锂选择沉淀RNARNA。RNA提取的通用方法影响影响RNA提取的因素提取的因素q 材料材料:新鲜,切忌使用反复冻融的材料新鲜,切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难,且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮如若材料来源困难,且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在存在TRIzolTRIzol或样品贮存液中,于或样品贮存液中,于7070或或2020保存保存如要多次提取,请分成多份保存如要多次提取,请分成多份保存液氮长期保存,液氮长期保存,7070短期保存短期保存影响影响RNA提取的因素提取的因素q 样品破碎及裂解样品破碎及
3、裂解:根据不同材料选择不同的处理方法:根据不同材料选择不同的处理方法:培养细胞:培养细胞:通常可直接加裂解液裂解通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌:酵母和细菌:一般一般TRIzolTRIzol可直接裂解,对于一些特殊的材料可先用可直接裂解,对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁酶或者机械方法破壁动植物组织:动植物组织:先液氮研磨和匀浆,后加裂解液裂解。期间动作快速,先液氮研磨和匀浆,后加裂解液裂解。期间动作快速,样品保持冷冻样品保持冷冻样品量适当,保证充分裂解样品量适当,保证充分裂解为减少为减少DNADNA污染,可适当加大裂解液的用量污染,可适当加大裂解液的用量q 纯化:纯化:在使用氯仿抽提
4、纯化时,一定要充分混匀,且动作快速;在使用氯仿抽提纯化时,一定要充分混匀,且动作快速;经典的纯化方法,如经典的纯化方法,如 LiCl LiCl 沉淀等,虽然经济,但操作时间长,易沉淀等,虽然经济,但操作时间长,易造成造成 RNA RNA 降解;降解;柱离心式纯化方法:抽提速度快,能有效去除影响柱离心式纯化方法:抽提速度快,能有效去除影响 RNA RNA 后续酶反后续酶反应的杂质,是目前较为理想的选择。应的杂质,是目前较为理想的选择。影响RNA提取的因素RNA提取常见问题q RNA RNA 的降解的降解 q ODOD260260/OD/OD280280 比值偏低比值偏低q 电泳带型异常电泳带型异
5、常q 下游实验效果不佳下游实验效果不佳RNA降解q 新鲜细胞或组织:新鲜细胞或组织:裂解液的质量裂解液的质量外源外源RNaseRNase的污染的污染裂解液的用量不足裂解液的用量不足组织裂解不充分组织裂解不充分另另外外某某些些富富含含内内源源酶酶的的样样品品 (如如脾脾脏脏,胸胸腺腺等等),很很难避免难避免 RNA RNA 的降解。的降解。建建议议在在液液氮氮条条件件下下将将组组织织碾碾碎碎,并并且且匀匀浆浆时时使使用用更更多裂解液多裂解液。RNA降解q 冷冻样品:冷冻样品:样样品品取取材材后后应应立立即即置置于于液液氮氮中中速速冻冻,然然后后可可以以移移至至-70-70冰箱保存。样品要相对小一
6、点;冰箱保存。样品要相对小一点;先用液氮研磨,再加裂解液匀浆;先用液氮研磨,再加裂解液匀浆;样样品品与与裂裂解解液液充充分分接接触触前前避避免免融融化化,研研磨磨用用具具必必须须预冷,碾磨过程中及时补充液氮。预冷,碾磨过程中及时补充液氮。OD260/OD280 比值偏低q 蛋白质污染:蛋白质污染:不不要要吸吸入入中中间间层层及及有有机机相相,加加入入氯氯仿仿后后首首先先混混匀匀,并并且且离离心心分分层的离心力和时间要足够。层的离心力和时间要足够。减少起始样品量,确保裂解完全、彻底减少起始样品量,确保裂解完全、彻底解决办法解决办法:重新抽提一次,再沉淀,溶解。重新抽提一次,再沉淀,溶解。q 苯酚
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