DNA提取及常见问题分析.pptx
《DNA提取及常见问题分析.pptx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《DNA提取及常见问题分析.pptx(30页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
第一部分:第一部分:DNA提取方法简介提取方法简介第二部分:第二部分:DNA提取常见问题、提取常见问题、原因分析及其对策原因分析及其对策内容内容第一部分:第一部分:DNA提取方法简介提取方法简介DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此此DNA的提取是分子生物学实验技术中最重要、的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作最基本的操作。前言前言DNA提取的几种方法提取的几种方法q染色体染色体DNADNA的提取的提取CTAB法法SDS法法其它其它DNA提取的几种方法提取的几种方法q非染色体非染色体DNA的提取的提取质粒质粒DNA的提取的提取 碱裂解法碱裂解法 煮沸法煮沸法线粒体、叶绿体线粒体、叶绿体DNA的提取的提取 差速离心结合差速离心结合SDS裂解法裂解法基因组基因组DNA CTAB法法qCTAB法原理法原理(植物(植物DNA提取经典方法)提取经典方法)CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合物。物。该复合物在高盐溶液中(该复合物在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的,通过有机溶剂)是可溶的,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。出来。注:注:CTAB溶液在低于溶液在低于15 时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15。qCTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方 组份组份 Tris-HCl (pH8.0)EDTA(pH8.0)NaCl CTAB-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%(V/V)使用前加)使用前加入入Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子,抑制离子,抑制DNase活性;活性;NaCl 提供一个高盐环境,使提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中;充分溶解,存在于液相中;CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组基因组DNA CTAB法法qCTAB提取缓冲液的改进配方提取缓冲液的改进配方 组份组份 Tris-HCl(pH8.0)EDTA(pH8.0)NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%(V/V)使用前加入使用前加入vPVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。和多糖结合,有效去除多糖。基因组基因组DNA CTAB法法qCTAB法流程图法流程图植物材料植物材料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液基因组基因组DNA CTAB法法q SDS法原理法原理基因组基因组DNASDS法法SDS是是一一种种阴阴离离子子去去垢垢剂剂,在在高高温温(5565)条条件件下下能能裂裂解解细细胞胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸;使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸;提提高高盐盐(KAc或或NH4Ac)浓浓度度并并降降低低温温度度(冰冰浴浴),使使蛋蛋白白质质及及多多糖糖杂质沉淀,离心后除去沉淀;杂质沉淀,离心后除去沉淀;上上清清液液中中的的DNA用用酚酚/氯氯仿仿抽抽提提,反反复复抽抽提提后后用用乙乙醇醇沉沉淀淀水水相相中中的的DNA。组份组份Tris-HCl(pH8.0)EDTA(pH 8.0)NaCl SDS终浓度终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2%q SDS法法DNA提取缓冲液提取缓冲液q SDS SDS法流程图法流程图 (以动物组织为例)(以动物组织为例)动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液基因组基因组DNASDS法法基因组基因组DNA其它方法其它方法物理方式物理方式:玻璃珠法、:玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法超声波法、研磨法、冻融法化学方式化学方式:异硫氰酸胍法、碱裂解法:异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式生物方式:酶法:酶法q根据细胞裂解方式的不同有:根据细胞裂解方式的不同有:基因组基因组DNA其它方法其它方法吸附材料结合法:吸附材料结合法:q根据核酸分离纯化方式的不同有:根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料硅质材料阴离子交换树脂阴离子交换树脂磁珠磁珠高盐低高盐低pHpH值结合核酸,低盐高值结合核酸,低盐高pHpH值洗脱。值洗脱。快捷高效。快捷高效。低盐高低盐高pHpH值结合核酸,高盐低值结合核酸,高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物,从而达到分离目的。物,从而达到分离目的。基因组基因组DNA其它方法其它方法浓盐法浓盐法:有机溶剂抽提法:有机溶剂抽提法:密度梯度离心法:密度梯度离心法:利用利用RNP和和DNP在盐溶液中溶解度不同,将二者分离在盐溶液中溶解度不同,将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂,同时抑制核酸酶的降解作用有机溶剂作为蛋白变性剂,同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物质粒质粒DNA碱裂解法碱裂解法q碱裂解法原理碱裂解法原理染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多,且染色体分子大得多,且染色体DNADNA为为线状分线状分子,而质粒子,而质粒DNADNA为共价闭合环状分子;为共价闭合环状分子;当用碱处理当用碱处理DNADNA溶液时,线状染色体溶液时,线状染色体DNADNA容易发生变性,共容易发生变性,共价闭环的质粒价闭环的质粒DNADNA在回到中性在回到中性pHpH时即恢复其天然构象;时即恢复其天然构象;变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀,而复性的超螺旋质粒淀,而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液相分子则以溶解状态存在液相中,从而可通过离心将两者分开。中,从而可通过离心将两者分开。质粒质粒DNA碱裂解法碱裂解法q碱裂解法流程图碱裂解法流程图对数期菌体对数期菌体溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重悬充分重悬溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液质粒质粒DNA煮沸法煮沸法q煮沸法原理煮沸法原理染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多,且染色体分子大得多,且染色体DNADNA为为线状分线状分子,而质粒子,而质粒DNADNA为共价闭合环状分子;为共价闭合环状分子;当加热处理当加热处理DNADNA溶液时,线状染色体溶液时,线状染色体DNADNA容易发生变性,共容易发生变性,共价闭环的质粒价闭环的质粒DNADNA在冷却时即恢复其天然构象;在冷却时即恢复其天然构象;变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀,而复性的超螺旋质粒淀,而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液相分子则以溶解状态存在液相中,从而可通过离心将两者分开。中,从而可通过离心将两者分开。细胞器细胞器DNA差速离心法差速离心法q差速离心法原理差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质(蔗糖)中,以一定的转速进将待分离物质置于均匀介质(蔗糖)中,以一定的转速进行离心,比重大的物质优先沉降,比重小的却处于上层,行离心,比重大的物质优先沉降,比重小的却处于上层,从而得以分离。从而得以分离。线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器,自身可编码蛋线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器,自身可编码蛋白,它们的白,它们的比重和大小一定,因而在同一离心场内的沉降速度比重和大小一定,因而在同一离心场内的沉降速度也一定,根据这一原理,常用不同转速的离心法,将细胞内各也一定,根据这一原理,常用不同转速的离心法,将细胞内各种组分分级分离出来。种组分分级分离出来。第一部分:第一部分:DNA提取方法简介提取方法简介第二部分:第二部分:DNA提取常见问题、提取常见问题、原因分析及其对策原因分析及其对策内容内容第二部分:第二部分:DNA提取常见问题、提取常见问题、原因分析及其对策原因分析及其对策DNA提取的基本步骤提取的基本步骤I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸,并去除杂质沉淀或吸附核酸,并去除杂质V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中材料准备材料准备最好使用新鲜材料,最好使用新鲜材料,低温保低温保存的样品材料不要反复冻融存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组提取血液基因组DNA时,要时,要选择有核细胞(白细胞)选择有核细胞(白细胞)组培细胞培养时间不能过长,组培细胞培养时间不能过长,否则会造成否则会造成DNA降解降解含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量较含量较少,提取前先富集少,提取前先富集基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取使用处于对数期的新鲜菌体(老化使用处于对数期的新鲜菌体(老化菌体导致开环质粒增加)菌体导致开环质粒增加)培养时应加入筛选压力,否则菌体培养时应加入筛选压力,否则菌体易污染,质粒易丢失易污染,质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒,如为低拷尽量选择高拷贝的质粒,如为低拷贝或大质粒,则应加大菌体用量贝或大质粒,则应加大菌体用量菌株不要频繁转接(质粒丢失)菌株不要频繁转接(质粒丢失)细胞裂解细胞裂解材料应适量,过多会影响裂解,材料应适量,过多会影响裂解,导致导致DNA量少,纯度低量少,纯度低针对不同材料,选择适当的裂针对不同材料,选择适当的裂解预处理方式:解预处理方式:植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时,定时轻柔振荡高温温浴时,定时轻柔振荡基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取菌体量适当菌体量适当培养基去除干净,同时保证菌体培养基去除干净,同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长(变性的时间不要过长(5分钟),分钟),否则质粒易被打断否则质粒易被打断复性时间也不宜过长,否则会有复性时间也不宜过长,否则会有基因组基因组DNA的污染的污染G菌、酵母质粒的提取,应先菌、酵母质粒的提取,应先用酶法或机械法处理,以破壁用酶法或机械法处理,以破壁核酸分离、纯化核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DNA时,应提时,应提供相应的缓冲体系供相应的缓冲体系采用有机(酚采用有机(酚/氯仿)抽提时应充分混匀,但氯仿)抽提时应充分混匀,但动作要轻柔动作要轻柔离心分离两相时,应保证一定的转速和时间离心分离两相时,应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点,在提取过程中辅以相应针对不同材料的特点,在提取过程中辅以相应的去杂质的方法的去杂质的方法基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取核酸分离、纯化核酸分离、纯化q蛋白质的去除:蛋白质的去除:酚酚/氯仿抽提氯仿抽提使用变性剂变性(使用变性剂变性(SDSSDS、异硫氰酸胍等)、异硫氰酸胍等)高盐洗涤高盐洗涤蛋白酶处理蛋白酶处理q多糖的去除:多糖的去除:高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入1/21/2体体积的积的5M NaCl5M NaCl,高盐可溶解多糖。,高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2(1/2体积体积),氯苯可,氯苯可以与多糖的羟基作用,从而去除多糖以与多糖的羟基作用,从而去除多糖 。用用PEGPEG80008000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA:在:在500L DNA500L DNA液中加入液中加入200l 20%PEG200l 20%PEG8000 8000(含含1.2 M NaCl)1.2 M NaCl),冰浴,冰浴20min20min。核酸分离、纯化核酸分离、纯化q多酚的去除:多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:-巯基乙醇、巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂:如加入易与酚类结合的试剂:如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇),它,它们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与DNADNA的结合的结合核酸分离、纯化核酸分离、纯化q盐离子的去除:盐离子的去除:7070的乙醇洗涤的乙醇洗涤核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时,用预冷的乙醇或异丙醇沉淀,当沉淀时间有限时,用预冷的乙醇或异丙醇沉淀,沉淀会更充分沉淀会更充分沉淀时加入沉淀时加入1/10体积的体积的NaOAc(pH5.2,3M),有),有利于充分沉淀利于充分沉淀沉淀后应用沉淀后应用70的乙醇洗涤,以除去盐离子等的乙醇洗涤,以除去盐离子等晾干晾干DNA,让乙醇充分挥发(不要过分干燥),让乙醇充分挥发(不要过分干燥)若长期储存建议使用若长期储存建议使用TE缓冲液溶解缓冲液溶解TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+离子,抑制离子,抑制DNasepH值为值为8.0,可防止,可防止DNA发生酸解发生酸解基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取1.1.DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚类杂质糖、多酚类杂质2.2.DNADNA在溶解前,有酒在溶解前,有酒精残留,酒精抑制精残留,酒精抑制后续酶解反应后续酶解反应3.3.DNADNA中残留有金属离中残留有金属离子子原因原因对对策策1.1.重新纯化重新纯化DNADNA,去除蛋,去除蛋白、多糖、多酚等杂白、多糖、多酚等杂质(具体方法见前)质(具体方法见前)2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA,让酒精,让酒精充分挥发充分挥发3.3.增加增加7070乙醇洗涤的乙醇洗涤的次数(次数(2-32-3次)次)DNA提取常见问题提取常见问题q问题一:问题一:DNADNA样品不纯,抑制后续酶解和样品不纯,抑制后续酶解和PCRPCR反应。反应。1.1.材料不新鲜或反复冻材料不新鲜或反复冻融融2.2.未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶的活性3.3.提取过程操作过于剧提取过程操作过于剧烈,烈,DNADNA被机械打断被机械打断4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反复冻融反复冻融原原因因对对策策1.1.尽量取新鲜材料,低温保存材料避尽量取新鲜材料,低温保存材料避免反复冻融免反复冻融2.2.液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻前加入裂解缓冲液前加入裂解缓冲液3.3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料在提取内源核酸酶含量丰富的材料的的DNADNA时,可增加裂解液中螯合剂时,可增加裂解液中螯合剂的含量的含量4.4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.5.所有试剂用无菌水配制,耗材经高所有试剂用无菌水配制,耗材经高温灭菌温灭菌6.6.将将DNADNA分装保存于缓冲液中,避免分装保存于缓冲液中,避免反复冻融反复冻融DNA提取常见问题提取常见问题q问题二:问题二:DNADNA降解。降解。1.1.实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗涤时洗涤时DNADNA丢失丢失原原因因对对策策1.1.尽量选用新鲜(幼嫩)的材尽量选用新鲜(幼嫩)的材料料2.2.动植物要匀浆研磨充分;动植物要匀浆研磨充分;G G菌、酵母裂解前先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁或机械方式破壁3.3.高温裂解时,时间适当延长高温裂解时,时间适当延长(对于动物细胞、细菌可增(对于动物细胞、细菌可增加加PKPK的用量)的用量)4.4.低温沉淀,延长沉淀时间低温沉淀,延长沉淀时间5.5.加辅助物,促进沉淀加辅助物,促进沉淀6.6.洗涤时,最好用枪头将洗涤洗涤时,最好用枪头将洗涤液吸出,勿倾倒液吸出,勿倾倒DNA提取常见问题提取常见问题q问题三:问题三:DNADNA提取量少。提取量少。谢谢大家!谢谢大家!- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- DNA 提取 常见问题 分析
咨信网温馨提示:
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,个别因单元格分列造成显示页码不一将协商解决,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【w****g】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【w****g】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,个别因单元格分列造成显示页码不一将协商解决,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【w****g】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【w****g】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。
关于本文