DNA提取及常见问题分析.pptx
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1、第一部分:第一部分:DNA提取方法简介提取方法简介第二部分:第二部分:DNA提取常见问题、提取常见问题、原因分析及其对策原因分析及其对策内容内容第一部分:第一部分:DNA提取方法简介提取方法简介DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此此DNA的提取是分子生物学实验技术中最重要、的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作最基本的操作。前言前言DNA提取的几种方法提取的几种方法q染色体染色体DNADNA的提取的提取CTAB法法SDS法法其它其它DNA提取的几种方法提取的几种方法q非
2、染色体非染色体DNA的提取的提取质粒质粒DNA的提取的提取 碱裂解法碱裂解法 煮沸法煮沸法线粒体、叶绿体线粒体、叶绿体DNA的提取的提取 差速离心结合差速离心结合SDS裂解法裂解法基因组基因组DNA CTAB法法qCTAB法原理法原理(植物(植物DNA提取经典方法)提取经典方法)CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合物。物。该复合物在高盐溶液中(该复合物在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的,
3、通过有机溶剂)是可溶的,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。出来。注:注:CTAB溶液在低于溶液在低于15 时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15。qCTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方 组份组份 Tris-HCl (pH8.0)EDTA(pH8.0)NaCl CTAB-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1
4、%(V/V)使用前加)使用前加入入Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子,抑制离子,抑制DNase活性;活性;NaCl 提供一个高盐环境,使提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中;充分溶解,存在于液相中;CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组基因组DNA CTAB法法qCTAB提取缓冲液的改进配方提取缓
5、冲液的改进配方 组份组份 Tris-HCl(pH8.0)EDTA(pH8.0)NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%(V/V)使用前加入使用前加入vPVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。和多糖结合,有效去除多糖。基因组基因组DNA CTAB法法qCTAB法流程图法流程图植物材料植物材料裂解液裂解液上层
6、溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液基因组基因组DNA CTAB法法q SDS法原理法原理基因组基因组DNASDS法法SDS是是一一种种阴阴离离子子去去垢垢剂剂,在在高高温温(5565)条条件件下下能能裂裂解解细细胞胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸;使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸;提提高高盐盐(KAc或或NH4Ac)浓浓度度并并降降低低温温度度(冰冰浴浴),使使蛋蛋白白质质及及多多糖糖杂质沉淀,离心后除去沉淀;杂质沉淀,离心后除去沉淀;上上清清液液中中的的DNA用用酚酚/氯氯仿仿抽抽提提,反反复复抽抽提提后
7、后用用乙乙醇醇沉沉淀淀水水相相中中的的DNA。组份组份Tris-HCl(pH8.0)EDTA(pH 8.0)NaCl SDS终浓度终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2%q SDS法法DNA提取缓冲液提取缓冲液q SDS SDS法流程图法流程图 (以动物组织为例)(以动物组织为例)动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液基因组基因组DNASDS法法基因组基因组DNA其它方法其它方法物理方式物理方式:玻璃珠法、:玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法超声波法、研磨法、冻融法化学方式化学方式:异硫氰酸胍
8、法、碱裂解法:异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式生物方式:酶法:酶法q根据细胞裂解方式的不同有:根据细胞裂解方式的不同有:基因组基因组DNA其它方法其它方法吸附材料结合法:吸附材料结合法:q根据核酸分离纯化方式的不同有:根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料硅质材料阴离子交换树脂阴离子交换树脂磁珠磁珠高盐低高盐低pHpH值结合核酸,低盐高值结合核酸,低盐高pHpH值洗脱。值洗脱。快捷高效。快捷高效。低盐高低盐高pHpH值结合核酸,高盐低值结合核酸,高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物
9、,从而达到分离目的。物,从而达到分离目的。基因组基因组DNA其它方法其它方法浓盐法浓盐法:有机溶剂抽提法:有机溶剂抽提法:密度梯度离心法:密度梯度离心法:利用利用RNP和和DNP在盐溶液中溶解度不同,将二者分离在盐溶液中溶解度不同,将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂,同时抑制核酸酶的降解作用有机溶剂作为蛋白变性剂,同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物质粒质粒DNA碱裂解法碱裂解法q碱裂解法原理碱裂解法原理染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多,且染色体分子大得多,且染色体DNADNA为为线状分线状分子,而
10、质粒子,而质粒DNADNA为共价闭合环状分子;为共价闭合环状分子;当用碱处理当用碱处理DNADNA溶液时,线状染色体溶液时,线状染色体DNADNA容易发生变性,共容易发生变性,共价闭环的质粒价闭环的质粒DNADNA在回到中性在回到中性pHpH时即恢复其天然构象;时即恢复其天然构象;变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀,而复性的超螺旋质粒淀,而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液相分子则以溶解状态存在液相中,从而可通过离心将两者分开。中,从而可通过离心将两者分开。质粒质粒DNA碱裂解法碱裂解法q碱裂解法流程图碱裂
11、解法流程图对数期菌体对数期菌体溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重悬充分重悬溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液质粒质粒DNA煮沸法煮沸法q煮沸法原理煮沸法原理染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多,且染色体分子大得多,且染色体DNADNA为为线状分线状分子,而质粒子,而质粒DNADNA为共价闭合环状分子;为共价闭合环状分子;当加热处理当加热处理DNADNA溶液时,线状染色体溶液时,线状染色体DNADNA容易发生变性,共容易发生变性,共价闭环的质粒价闭环的质粒DNADNA在冷却时即恢复其天然
12、构象;在冷却时即恢复其天然构象;变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀,而复性的超螺旋质粒淀,而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液相分子则以溶解状态存在液相中,从而可通过离心将两者分开。中,从而可通过离心将两者分开。细胞器细胞器DNA差速离心法差速离心法q差速离心法原理差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质(蔗糖)中,以一定的转速进将待分离物质置于均匀介质(蔗糖)中,以一定的转速进行离心,比重大的物质优先沉降,比重小的却处于上层
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