免疫组化实验方法.pptx
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1、免疫组化实验方法免疫组织化学的概念免疫组织化学的概念 利用抗原与抗体特异性结合的原理,通利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学。化学。2最突出的优点最突出的优点在更广阔的范围内,把结构与功能及代谢把结构与功能及代谢结合起来结合起来,在微观世界原位地原位地确定组织及细胞结构的化学成分,达到方法统一,定方法统一
2、,定性可靠,定位准确,定量可能性可靠,定位准确,定量可能。3免疫组化实验标本免疫组化实验标本组织标本(石蜡切片和冰冻切片)细胞标本(组织印片、细胞爬片和细胞涂片)。石蜡切片对于组织形态保存好,且能作连续切片,有利于各种染色对照观察;还能长期存档;4细胞和组织的固定细胞和组织的固定1固定的作用固定的作用-使细胞内蛋白质凝固、终止或抑制外源性和内源性酶活性,最大限度地保存细胞和组织的抗原性,使水溶性抗原转变为非水溶性抗原,防止抗原弥散。2选择选择最佳固定液的最佳固定液的标准标准:保持组织形态结构;保存抗原性。(1)醛类固定剂:穿透性较强,收缩性小,是常用的固定剂。如10中性福尔马林液、4多聚甲醛缓
3、冲液、戊二醛-甲醛液、乙酸-甲醛液等。(2)非醛类固定剂:适用于多肽类激素的组织固定,常与戊二醛或多聚甲醛混合使用。(3)丙酸及醇类固定剂:沉淀蛋白质和糖,保存抗原性较好。但对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差,和其它试剂混合使用加以解决,如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。3常用常用的固定的固定方法方法-浸入浸入法法和灌注法灌注法(适用于动物实验研究)组织新鲜 勿干燥 体积适中 固定液足够(20倍)5抗体抗体常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体单克隆抗体和多克隆抗体。特性比较:1.均一性2.稳定性3.特异性4.重复性5.沉淀反应6荧光素标记抗体荧光素标记抗体 能够产生荧光并能作为染料的
4、化合物称为荧光色素荧光色素。必备条件:荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明,能清晰判断结果。结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响,用于活体内标记,结合物应无毒,附加抗原性小。7常用的染色方法常用的染色方法根据标记物的不同分为免疫荧光法,免疫免疫荧光法,免疫酶标法,亲和组织化学法酶标法,亲和组织化学法按标记物定位于抗原所在部位的手段,则可将免疫细胞组织化学染色方法分为直接直接法(一步法)、间接法(二步法)、桥连法(一步法)、间接法(二步法)、桥连法法等。每进行一步结合反应。都会产生一次阳性结果的放大效应。敏感性由高到低敏感性由高到低依次为桥连法、间接法、直接法依次为桥连法、间接法
5、、直接法。8染色的基本程序染色的基本程序标记抗体与标本中抗原反应结合;用缓冲液洗去未结合的成分;直接观察结果;或显色后再用显微镜观察。9反应条件反应条件抗原抗体结合属于可逆性反应,具有共性的反应条件:(1)PH:中性及弱硷性条件(PH 78)有利于免疫复合物的形成(2)离子强度离子强度:0.010.02 M的低离于强度有利于免疫复合物的形成(3)去污剂去污剂:有利于复合物的形成,常用的非离子型去污剂有吐温-20,EDTA(0.01%),Triton X-100(0.11%)(4)抗体稀释液中蛋白质浓度抗体稀释液中蛋白质浓度:稀释液中含无关蛋白质可以减少抗体的非特异吸附,常用牛血清白蛋白(5)防
6、腐剂防腐剂:微生物生长会干扰抗原抗体反应,稀释液和抗体液中加入适量的叠氮钠或硫柳汞以防腐(6)温度和时间温度和时间:较高的反应温度(37)可加速抗原抗体结合反应,低温有利于抗原抗体结合率的提高(7)洗涤洗涤:除去未结合抗原或抗体,除去非特异性吸附造成的背景染色。选用自来水、生理盐水或PBS等,加去污剂并在洗涤过程中加以振摇10荧光素荧光素 1,异硫氰酸荧光黄异硫氰酸荧光黄(fluorescein isothiocyanate,FITC)黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末,最大吸收光谱为490495 nm,最大发射光谱为520530 nm,呈现明亮的黄绿色黄绿色荧光。最常用。2四甲基异硫四甲基异硫氰酸
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