兽医学畜牧学遗传的物质基础.pptx

第三章第三章 遗传的物质基础遗传的物质基础第一节 遗传物质的本质一、一、DNA是遗传物质是遗传物质（一）（一）DNA是遗传物质的证明是遗传物质的证明n1928年年Griffith等进行的肺炎球菌转化等进行的肺炎球菌转化（transformation）实验）实验.n1944年年Avery证明证明DNA是遗传物质是遗传物质.（二）（二）DNA携带两类不同的遗传携带两类不同的遗传信息信息1.负责基因结构的信息负责基因结构的信息2.负责基因选择性表达的信息负责基因选择性表达的信息二、二、RNA也可作为遗传物质也可作为遗传物质（一）（一）RNA病毒病毒病毒颗粒（病毒颗粒（viron）：由病毒：由病毒RNA基基因组和包被在外的蛋白质外壳组成因组和包被在外的蛋白质外壳组成.病毒的生存方式：病毒的生存方式：病毒编码包装基因病毒编码包装基因组所需的蛋白，以及一些在感染循环组所需的蛋白，以及一些在感染循环中复制病毒所需的蛋白质。其他蛋白中复制病毒所需的蛋白质。其他蛋白质由宿主提供。因此病毒不能独立生质由宿主提供。因此病毒不能独立生存。存。（二）类病毒（二）类病毒（viroid）类病毒类病毒:是使高等植物产生疾病的有传染是使高等植物产生疾病的有传染性的因子，由很小的环状性的因子，由很小的环状RNA分子构成。分子构成。与病毒不同，类病毒的与病毒不同，类病毒的RNA本身就是感染本身就是感染因子。类病毒只由因子。类病毒只由RNA组成，其中广泛组成，其中广泛存在不完全的碱基配对，形成一种特有存在不完全的碱基配对，形成一种特有的棒状结构。类病毒的基因组不能编码的棒状结构。类病毒的基因组不能编码蛋白质。蛋白质。类病毒的复制：类病毒的复制：必须由宿主的酶来完成，必须由宿主的酶来完成，其其RNA作为模板。作为模板。类病毒对宿主的影响：类病毒对宿主的影响：类病毒可通过复制类病毒可通过复制占有宿主细胞中关键的酶，从而影响宿占有宿主细胞中关键的酶，从而影响宿主细胞的正常功能；类病毒也能影响必主细胞的正常功能；类病毒也能影响必需的需的RNA的产生而引发疾病；它们还可的产生而引发疾病；它们还可以作为一个不正常的调控分子，对个别以作为一个不正常的调控分子，对个别基因的表达产生特殊的影响。基因的表达产生特殊的影响。三、是否存在核酸之外的遗传物质？三、是否存在核酸之外的遗传物质？（一）朊病毒（一）朊病毒（prion）：）：是一个是一个28KDa的疏水性糖蛋白，由细胞的疏水性糖蛋白，由细胞的核基因编码，在正常动物的脑组织中的核基因编码，在正常动物的脑组织中有表达。有表达。（二）朊病毒的存在形式：（二）朊病毒的存在形式：朊病毒以感染性形式（朊病毒以感染性形式（PrPSC)，和非感，和非感染性形式（染性形式（PrPC）两种形式存在。）两种形式存在。（三）两种形式的朊病毒的异同：（三）两种形式的朊病毒的异同：PrPC PrPSC功能功能：不详不详 导致退行性神经疾病导致退行性神经疾病分分 布：布：正常脑正常脑 被感染脑被感染脑抗蛋白酶性：抗蛋白酶性：可被完全降解可被完全降解 只能被部分降解只能被部分降解溶解性：溶解性：可溶可溶 难溶难溶 一级结构：一级结构：两者相同两者相同二级结构：二级结构：40%-螺旋螺旋 20%-螺旋，螺旋，50%-折叠折叠（四）朊病毒的感染方式（四）朊病毒的感染方式PrPSC 作用需要作用需要PrPC 的参与的参与PrPSC 蛋白的错误折叠形式可以催化蛋白的错误折叠形式可以催化天然天然PrPC分子从正常的可溶性的分子从正常的可溶性的 螺螺旋构象向不溶性的旋构象向不溶性的-折叠构象转化，折叠构象转化，最终导致了疾病和感染。最终导致了疾病和感染。（五）朊病毒的多株现象（五）朊病毒的多株现象不同不同PrPSC株可使一种株可使一种PrP结构转化为不同的构结构转化为不同的构型；而同一种型；而同一种PrPSC可以在具有不同可以在具有不同PrP蛋白蛋白的多种生物中传代，即使经过多次传代仍然保的多种生物中传代，即使经过多次传代仍然保持自身的生物学特征。持自身的生物学特征。（六）朊病毒是遗传物质吗？（六）朊病毒是遗传物质吗？多株现象难以解释多株现象难以解释其感染方式能否被视为遗传复制？其感染方式能否被视为遗传复制？第二节 DNA的一级结构一、DNA一级结构的组成 一级结构：4种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序。(一）含氮碱基（含氮碱基（nitrogenous bases）胞嘧啶（cytosine,C）、胸腺嘧啶（thymine,T）、腺嘌呤（adenine,A）、鸟嘌呤（guanine,G）DNA中的常见碱基有：胞嘧啶（cytosine,C）、胸腺嘧啶（thymine,T）、腺嘌呤（adenine,A）和鸟嘌呤（guanine,G）(二）戊糖：核糖和脱氧核糖（三）脱氧核糖核苷（三）脱氧核糖核苷（nucleoside）由碱基和戊糖（D-脱氧核糖）缩合而成。有4种脱氧核糖核苷：胞嘧啶脱氧核糖核苷、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷和鸟嘌呤脱氧核糖核苷。+H2OH（四）脱氧核糖核苷酸（四）脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷和磷酸缩合形成的磷酸酯（五）脱氧核糖核酸（五）脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）脱氧核糖核苷酸以3，5磷酸二酯键聚合成为脱氧核糖核酸（DNA）链。链的一端的核苷酸有自由的5磷酸基团，称5端；另一端核苷酸具有自由的3羟基，称3端。一个脱氧核苷一个脱氧核苷酸的酸的3端与下一端与下一个的个的5端通过磷端通过磷酸二酯键连接。酸二酯键连接。DNA链的方向就是从5端到3端。DNA分子通常以线性或环状的形式存在。大多数DNA由两条互补的单链构成。少数生物的DNA，如某些噬菌体或病毒是以单链形式存在的。二、序列测定方法（一）小片段重叠法（一）小片段重叠法（二）凝胶直读法（二）凝胶直读法 1.酶法（1）加减法（Sanger,1975）（2）末端终止法(双脱氧法/间接拷贝法)（Sanger,1977）2.化学法（Maxam/Gilbert,1977）适用于DNA短片段的测定末端终止法的应用末端终止法的应用循环测序（循环测序（cycle sequecing)cycle sequecing)实验及原理实验及原理 a.a.测序反应的设定测序反应的设定体系中包括：体系中包括：DNADNA模板，模板，TaqDNATaqDNA聚合酶，寡核苷酸引物，聚合酶，寡核苷酸引物，4 4种种dNTPdNTP和荧光和荧光ddNTPddNTP（4 4种荧光）等种荧光）等b.b.反应反应包括：包括：DNADNA变性，引物与模板配对，变性，引物与模板配对，DNADNA聚合酶使引物延伸（在引物聚合酶使引物延伸（在引物3 3末末端接上端接上dNTPdNTP或或ddNTPddNTP）；）；c.c.反应的终止反应的终止20-3020-30个循环后，新合成所有可能的个循环后，新合成所有可能的DNADNA片段，每个片段的片段，每个片段的3 3末端都被接末端都被接上上ddNTPddNTP，延伸终止；，延伸终止；d.d.反应产物电泳分离及检测反应产物电泳分离及检测在聚丙烯凝胶中，不同大小的在聚丙烯凝胶中，不同大小的DNADNA片段在高压电场作用下迁移，小分子迁片段在高压电场作用下迁移，小分子迁移速度快，先被位于凝胶底部的装置检测到。移速度快，先被位于凝胶底部的装置检测到。e.e.结果的处理及输出结果的处理及输出根据被检测到的根据被检测到的DNADNA片段的顺序及颜色，绘出片段的顺序及颜色，绘出DNADNA片段的电泳图谱。片段的电泳图谱。DNADNA序序列中的每个核苷酸由一系列按顺序排列的彩色峰型显示出来列中的每个核苷酸由一系列按顺序排列的彩色峰型显示出来双脱氧核苷三磷酸酶、4种dNTPddATP5TACGATCGTA35TACGA35TA3ddGTP5TACGATCGTATG35TACGATCG35TACG35TACGATCGTAT35TACGATCGT35TACGAT35T35TACGATC35TAC3ddTTPddCTPAGTCGTATGCTAGCAT3ATGCTAGCATAC553模板引物 三、一级结构的重要性 携带遗传信息决定DNA的二级结构决定DNA的空间结构第三节 DNA的二级结构 一、DNA螺旋的几种构象及其动态平衡（一）（一）Watson Crick右手双螺旋结构右手双螺旋结构 （B-DNAB-DNA构象）构象）相对湿度为92%时，DNA钠盐纤维为B-DNA构象。在天然情况下，绝大多数DNA以B构象存在。a.反平行双链右手螺旋b.糖Pi在螺旋线上c.碱基伸向内部其平面垂直于轴d.A=T、G=Ce.直径=2nm，一圈上升10对核苷酸，螺距为3.4nmf.大沟（majorgroove）、小沟（minorgroove）WatsonCrick双螺旋结构模型特点：双螺旋结构模型特点：n（二）（二）A-DNA构象构象n为相对湿度改变（75%以下）或由钠盐变为钾盐、铯盐，DNA的结构可成为A构象。它是B-DNA螺旋拧得更紧的状态。DNA-RNA杂交分子、RNA-RNA双链分子均采取A构象。n（三）（三）Z-DNA构象构象n在一定的条件下（如高盐浓度），DNA可能出现Z构象。Z-DNA是左手双螺旋，磷酸核糖骨架呈Z字性走向。不存在大沟，小沟窄而深，并具有更多的负电荷密度。A-型B-型Z-型A-DNA、B-DNA和Z-DNA的一些结构特征A-DNAB-DNAZ-DNA螺旋方向每圈螺旋的碱基数每一碱基对的上升距离螺距碱基对的倾斜度每一碱基对旋转的角度螺旋直径大沟小沟右手性110.255nm2.8nm20332.3nm窄而极深极宽而浅右手性10.40.34nm3.4nm6362.0nm宽而深窄而深左手性120.37nm4.5nm7-601.8nm平展极窄而深nB-DNA是活性最高的DNA构象，B-DNA变成A-DNA后，仍有活性，但若局部变构为Z-DNA后，活性明显降低。二、决定双螺旋结构状态的因素（一）氢键（一）氢键1.碱基的氢供体氨基、羟基2.碱基的氢受体酮基、亚氨基3.G-C对及A-T对之间的氢键:（在一定范围内DNA的稳定性与G-C百分含量成正比）（二）碱基堆（二）碱基堆积力力1，碱基堆积力同一条链中的相邻碱基之间的非特异性作用力2，碱基堆积力的来源疏水作用力累积的Van der Waal的作用力3，碱基堆积作用的证据单链多核苷酸倾向于碱基平行排列的规则螺线结构破坏疏水作用和双链的氢键可降低DNA的稳定性Pu-PyPy-Pu碱基堆积形成积压碱基堆积形成积压Pu的双环结构，其的双环结构，其长度接近或超过螺长度接近或超过螺旋轴心旋轴心每对每对Bp又以又以propeller twist 形式存在形式存在相临两个相临两个Bp间的间的Pu发生过份的挤压导发生过份的挤压导致致Bp的抵牾的抵牾DNA分子的精细结分子的精细结构发生改变，产生构发生改变，产生构象的不安定状态构象的不安定状态Pu的抵牾发生的抵牾发生在小沟一侧在小沟一侧Pu的抵牾发生的抵牾发生在大沟一侧在大沟一侧2倍抵倍抵牾力牾力TA不稳定不稳定GC稳定稳定（三）带电荷的磷酸基的静电斥力三）带电荷的磷酸基的静电斥力磷酸集团的负电对DNA双链的稳定性起负作用。阳离子可对之产生屏蔽。DNA溶液的离子浓度越低，DNA越不稳定。（四）碱基分子内能（四）碱基分子内能碱基内能越高，氢键和碱基堆积力越容易被破坏，DNA双链越不稳定第四节 DNA的三级结构 形成超螺旋的原因和条件：原因：因某种原因引入了额外的螺旋。条件：a,DNA双螺旋闭合或被蛋白结合，末端不能自由转动；b,DNA双链上无断裂。一、一、超螺旋结构DNA的三级结构是指DNA双螺旋的进一步扭曲盘绕所形成的构象，主要表现为超螺旋结构。松弛态（relaxedstate）:DNA中心轴与平面平行即不扭曲的状态。超螺旋：双螺旋结构的DNA再次扭曲形成的螺旋结构。a.右旋超螺旋负超螺旋（Negativesupercoil）b.左旋超螺旋正超螺旋（positivesupercoil）a.b.环状DNA分子的拓扑学性质 L=T+W W=L-T L L：连环数（Linking number）指一个封闭环状DNA双螺旋分子中的两条链彼此盘绕的次数；T T：双螺旋中转数（Twisting number，也叫螺圈数）是双螺旋本身所有的性质。其数量等于碱基对总数除以每一圈的碱基对数（如：520010.4=500）；W W：超螺旋数（Writhing number）。DNA的拓扑异构体：松弛型：W=0，L=T；负超螺旋：LT 例：动物病毒SV40的DNA（环状，含5200bp），在无超螺旋时，L=500，T=500，W=0；但实际上从细胞中分离出的SV40DNA含有25个负超螺旋，所以它的L=475，因此，L对一个DNA分子来讲是一个拓扑学特性，在不发生链的断裂时它是一个常数。（475=500-25）L=T+WW=L-T比连环差比连环差（Specific linking difference)（以表示）用来表示超螺旋的程度；当初级螺旋数不变时，代表超螺旋密度。公式：=（L-L0）/L0（L0：表示松弛环型DNA的连环数）如一超螺旋DNA的L=23，L0=25，则=-0.08，大多数天然存在的DNA分子超螺旋密度在-0.03-0.09之间。超螺旋结构存在的意义密度大，体积小，在细胞中所占体积较为经济；超螺旋结构能影响双螺旋的解链程度，因而影响DNA分子与其它分子，如酶、蛋白质等分子的相互作用，参与DNA复制、重组、转录等重要功能。DNA的拓扑异构体可用凝胶电泳分开。n影响DNA高级结构的酶 L值的改变需要至少一条DNA链断裂一次。断裂造成的DNA自由末段的一断可绕着另一端旋转，随后被重新连接，DNA拓扑异构酶通过催化此类反应将DNA从一种拓扑结构转变成另一种。l拓扑异构酶拓扑异构酶 (topoisomerase I,II)(topoisomerase I,II)参与构型的改变参与构型的改变功能比较拓拓扑扑酶酶功功能能比比较较TopI对负超螺旋处的对负超螺旋处的单链单链DNA具有极具有极强的亲合力强的亲合力TopII消除负超螺旋消除负超螺旋 松弛松弛B-DNA引入负超螺旋引入负超螺旋 紧缩紧缩B-DNAn1.I型型DNA拓扑异构酶拓扑异构酶底物：DNA单链ATP：不需 酶活性：DNA内切酶和连接酶活性代表：E.Coli的DNA拓扑异构酶I：可催化负超螺旋DNA转化为 松弛环型。鼠DNA拓扑异构酶I：对正、负超螺旋有相同的松弛能力。原理：E.coli拓扑异构酶识别部分解螺旋的DNA分子，与DNA单链部分结合后，切断一条链，并以其酪氨酸残基与DNA的5磷酸相连。磷酸二酯键从DNA转移蛋白质上。酶将完整的DNA链拉过缺口后（L=+1），重新连接原先单链上磷酸二酯键。n上述过程除了改变DNA的超螺旋结构外，还可使单链环状分子形成三叶结构，以及使两个单链环状分子成为环连体分子。v2.II型型DNA拓扑异构酶拓扑异构酶n底物 DNA双链nATP 需要n酶活性 DNA内切酶和连接酶活性n代表 E.Coli旋转酶（DNA拓扑异构酶II），可引入负超螺旋。无ATP时，此酶只能缓慢地松弛负超螺旋。E.Coli的旋转酶还具有形成和拆开双链DNA环连体和成结分子的能力。此类酶无碱基序列特异性。v3.DNA拓扑异构酶催化反应的实质：拓扑异构酶催化反应的实质：其本质是先切断DNA的磷酸二酯键，改变DNA的链环数后再连接，兼具DNA内切酶和DNA连接酶的功能。然而这些酶并不能连接事先已经存在的断裂DNA，即其断裂及连接反应是相互偶联的。二、生物体内的超螺旋1.环状DNA的超螺旋 生物体如某些小病毒、细菌质粒、真核线粒体、叶绿体、噬菌体PM2、以及某些细菌的DNA为双链环状，在细胞内进一步扭曲形成超螺旋的三级结构。2.染色体DNA的三级结构为DNA双螺旋盘绕在组蛋白上的超螺旋结构。H1DNA绕聚合体1.75圈，左旋H2A、H2B、H3、H4各2分子组成聚合体H1结合在核小体间的DNA上组蛋白三、三股螺旋三、三股螺旋DNA(Trible Helix DNA,T.S DNA)T.SDNA的发现与证实的发现与证实 l1953年以前年以前Pauling(Chemist)提出提出T.SDNA存在的可能性存在的可能性 l1953年年Watson&CrickD.SDNAmodel证明沿大沟存在多余的氢键给体与受体证明沿大沟存在多余的氢键给体与受体潜在的专一与潜在的专一与DNA(蛋白质蛋白质)结合的能力结合的能力形成形成T.SDNA可能性可能性l1957年年Davis,Felsenfeld,Rich 发现发现poly(U)+poly(U)+poly(A)T.SRNAT.SDNA的概念的概念l1966年年Miller&Sobell实现实现RNA+D.S DNA RNA+D.S DNA Trible polyNt as Repressoras Repressor关闭基因关闭基因但由于但由于D.SDNA的提出的提出而被忽视而被忽视但因证明但因证明LacI产物为产物为Repressor而被而被忽视忽视1975年年PerlgutPerlgut人工人工合成合成T.SDNA并证明其并证明其Tm值值,沉降系数沉降系数(S)l1987年年Mirkin.S.MMirkin.S.MNature 330(495)证明证明plasmidDNA在在pH=4.3的溶液中的溶液中,有有T.SDNA的存在的存在1987年年Dervan.MoserDervan.MoserScience 238(645)合成合成S.SDNA+D.SDNAT.SDNA实现实现DNA的定点切割的定点切割研究研究X-ray photographX-ray photograph核磁共振核磁共振结构功能结构功能继继Davis（1957）后）后30年年第一次证明第一次证明T.SDNA在生物体内的存在在生物体内的存在T.S.DNAT.S.DNA的类型的类型PolyT/ATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAPolyT/ATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAA1.D.S.DNA+D.S.DNAT.S.DNA+S.S.DNAHomologouspalindromicsequenceinaD.S.DNANoduleDNAorHingedDNA三链螺旋三链螺旋双链螺旋双链螺旋HingedDNAHingedDNA l2.S.S.DNA+D.S.DNAT.S.DNAPU+PU/PY(偏碱性介质中稳定偏碱性介质中稳定)PY+PU/PY(偏酸性介质中稳定偏酸性介质中稳定)常见类型常见类型l第三条链位于第三条链位于B-DNA的的Majorgroove中中l与与D.S.DNA一起旋转一起旋转T.S.DNA的连接键的连接键WatsonbondingATGC(D.S.DNA)H+HoogsteenbondingGC+(pH小于小于7)第三链第三链 质子化质子化 第二链的第二链的pu 6,7与第三链的碱基形成与第三链的碱基形成 H 键键 三股螺旋三股螺旋DNA形成的条件及结构特点形成的条件及结构特点第三条单链第三条单链DNA分子分子位于位于B-DNA大沟内大沟内与与B-DNA以以Hoogsteen键连接键连接TriblehelixMajorgroovePy:Pu:Py3ed在在Py/Pu:Py结构中结构中AT,GC+两氢键配对两氢键配对C质子化质子化镜相结构镜相结构必需条件必需条件T.S.DNA可能的功能可能的功能a)T.S.DNA可阻止调节蛋白与可阻止调节蛋白与DNA结合结合,关闭基因转录过程关闭基因转录过程b)T.S.DNA与基因重组与基因重组,交换有关交换有关c)加入第三条加入第三条S.S.DNA作为分子剪刀作为分子剪刀(molecularscissors),定点切割定点切割DNA分子分子d)加入反义的第三条链加入反义的第三条链(anti-sencepolydNt)终止基因的表达终止基因的表达四、四、四股螺旋四股螺旋DNA(tetraplex DNA,Tetrable Helix DNA)发现发现均有形成均有形成四股螺旋四股螺旋DNA的可能的可能5-TTAGGGTTAGGGTTAGGG-33-AATCCCAATCCC-5染色体端粒高度重复的染色体端粒高度重复的DNA序列序列着丝点附近的高度重复序列着丝点附近的高度重复序列结结 构构 特特 点点LinkedbyHoogsteenBonding7GGGG67677662poly(T4G4)2poly(G4C4)结结 构构 特特 点点53TTTGGGGGGGGGGGGGGGGGGTTTTTTGGGGTTTGGGGTTTGGGGTTT真核生物染色体端粒真核生物染色体端粒DNA结构结构可能的功能可能的功能A稳定真核生物染色体结构稳定真核生物染色体结构B保证保证DNA末端准确复制末端准确复制C与与DNA分子的组装有关分子的组装有关D与染色体的与染色体的meiosis&mitosis有关有关HoogsteenBonding5-TTAGGGTTAGGGTTAGGGT3-AATCCCAATCCCGGGTA 第五节 DNA的变性、复性、杂交和Cot曲线 一、DNA的变性的变性nDNA变性（熔解）：变性（熔解）：DNA被加热或某些试剂的作用下，被加热或某些试剂的作用下，配对碱基之间氢键和相邻碱基之间的堆积力受到破坏，配对碱基之间氢键和相邻碱基之间的堆积力受到破坏，逐步变为近似于无规则的线团构像的过程。逐步变为近似于无规则的线团构像的过程。（一）单、双链（一）单、双链DNA的紫外光吸收的紫外光吸收n双链双链DNA：A260=1.0时，时，50g/ml n单链单链DNA：A260=1.0时，时，33g/mln（单链（单链RNA：A260=1.0时，时，40g/ml）D.S.DNAS.S.DNA(加温加温,极端极端pH,尿素尿素,酰胺酰胺)（二）（二）DNA的熔解曲线的熔解曲线TmTm值值：缓慢而均匀地升高：缓慢而均匀地升高DNADNA溶液的温度，当溶液的温度，当A260A260增加增加到最大增值的一半时的温度，叫做到最大增值的一半时的温度，叫做DNADNA的熔解温度的熔解温度（Melting temperature）或熔点，用或熔点，用TmTm表示。（一般在表示。（一般在70-8570-85）DNADNA变性不仅受外部各种因素的影响，而且取决于变性不仅受外部各种因素的影响，而且取决于DNADNA分分子本身的稳定性，即子本身的稳定性，即TmTm值值直接与直接与DNADNA的性质相关。的性质相关。温度单链(%)10050Tm温度单链(%)10050TmTmTmPolyA-TDNApolyG-C1.1851.01.37OD=OD增加值的中点温度增加值的中点温度(一般为一般为85-95)Tm(meltingtemperature)=midpoint of the temperature range over which DNA is denatured 不同DNA的Tm值对G-C含量作图能得到一条直线，因此测定Tm值可以推算出DNA碱基分子组成。（三）（三）影响影响Tm值的因素值的因素在在A,T,C,G随机分布的情况下随机分布的情况下GC%含量相同的情况下含量相同的情况下GC%愈高愈高Tm值愈大值愈大GC%愈低愈低Tm值愈小值愈小AT形成变性核心，变性加快，形成变性核心，变性加快，Tm值小值小碱基排列对碱基排列对Tm值具有明显影响值具有明显影响（除变性核心外）（除变性核心外）（碱基堆积力的差异（碱基堆积力的差异）大片段大片段D.S.DNA分子之间比较分子之间比较片段长短对片段长短对Tm值的影响较小值的影响较小,与组成和排列相关与组成和排列相关小于小于100bp的的D.SDNA分子比较分子比较片段愈短，片段愈短，变性愈快，变性愈快，Tm值愈小值愈小变性液中含有尿素，酰胺等变性液中含有尿素，酰胺等尿素，酰胺与碱基间形成氢键尿素，酰胺与碱基间形成氢键改变碱基对间的氢键改变碱基对间的氢键Tm值值可降至可降至40左右左右盐浓度的影响盐浓度的影响单链单链DNA主链的磷酸基团主链的磷酸基团负电荷的静电斥力负电荷的静电斥力两条单链两条单链DNA的分离的分离Na+在磷酸基团周围形成的电子云在磷酸基团周围形成的电子云对静电斥力产生屏蔽作用对静电斥力产生屏蔽作用减弱静电斥力减弱静电斥力Tm当当Na+浓度低浓度低屏蔽作用小屏蔽作用小斥力加强斥力加强Tm静电斥力静电斥力熵值（熵值（S）TmODA2600.01M0.1M1.0MNa+当当Na+浓度高浓度高屏蔽作用大屏蔽作用大斥力减弱斥力减弱熵值熵值(S)上升上升碱基溶解性降低碱基溶解性降低疏水作用力增加疏水作用力增加二、复性二、复性DNADNA复性：变性复性：变性DNADNA在一定条件下恢复天在一定条件下恢复天然然DNADNA结构的过程。结构的过程。（一）复性的条件（一）复性的条件1 1，消除磷酸基的静电斥力；，消除磷酸基的静电斥力；2 2，破坏连内氢键，破坏连内氢键（二）复性的机制（二）复性的机制1 1，随机碰撞，随机碰撞取决于取决于DNADNA浓度、溶液温度、离子强度浓度、溶液温度、离子强度等等2 2，成核作用（，成核作用（nucleation)nucleation)3 3，拉拉链作用（，拉拉链作用（zipperingzippering）3-ATCTATGCTGTCAT-55-TAGATACGACAGTA-35-TAGATACGACAGTA-33-ATCTATGCTGTCAT-53-ATATATATATAT-55-TATATATATATA-33-ATATATATATAT-55-TATATATATATA-35-TATATATATATA-33-ATATATATATAT-53-ATATATATATAT-55-TATATATATATA-3影响影响DNA复性过程的因素复性过程的因素：阳离子浓度阳离子浓度0.180.2MNa+可消除可消除polydNt间的静电斥力间的静电斥力复性反应的温度复性反应的温度Tm-25(60-65)以消除以消除S.S.DNA分子内的部分二级结构分子内的部分二级结构S.S.DNA分子的长度分子的长度S.S.DNA愈长愈长S.S.DNA愈短愈短分子扩散愈慢分子扩散愈慢复性愈慢复性愈慢分子扩散愈快分子扩散愈快复性愈快复性愈快影响影响DNA复性过程的因素复性过程的因素：DNA分子中分子中,dNt的排列状况的排列状况(随机排列随机排列,重复排列重复排列)S.S,DNA的初始浓度的初始浓度C0l l三、三、CotCot曲线曲线在一定条件，复性速度变化可用Cot值衡量。Co表示变性DNA的最初浓度（bp，mol/L），T为复性时间（s），即Cot值为变性DNA的最初浓度与复性时间的乘积（mols/L）。病毒和原核生物基因组的Cot曲线是单一的s形曲线，真核生物基因组的Cot曲线是多s形Cot曲线，重复频率高的序列复性速度快，重复频率低的则慢。135001.71054.2106bpK.C.210-6810-2310-19Cot1/2不同物种核酸的不同物种核酸的不同物种核酸的不同物种核酸的CotCot曲线曲线曲线曲线原核生物DNA的复性动力学原核生物Cot曲线形状：不同生物曲线形状相似，都是单一的S形；原核生物Cot曲线：跨度一般只有两个数量级；原核生物Cot曲线位置：基因组越大越靠右。Cot（mols/L）真核生物Cot曲线特点：阶梯状，跨度7-8个数量级。真核生物Cot曲线的组成：快复性组分/中间复性组分/慢复性组分。真核生物DNA复性动力学 E.ColiDNACt/C0C0t0.036300040%60%Calf thymus DNA 10四、杂交重要的杂交技术：1.Southern Blotting2.Northern Blotting 一、RNA的结构特征nRNA的碱基组成与一级结构n（1）碱基组成：A、G、C、Un（2）一级结构：基本组成单位核苷酸（AMP、GMP、CMP、UMP）n核苷酸间的连接键35 磷酸二酯键n存在状态 单链、只有少数为双链（暗色蛾 CPVRNA 5150 bp）第六节 RNA的结构双螺旋、内部环、单碱基、突起和突环、发夹环、多分支环或结合环、假结、单链区二、二、RNA二级结构元件：二级结构元件：多分支环突环单碱基突起发夹结构（茎环结构）内部环双螺旋假结单链区三、mRNA结构1.原核生物mRNA为多顺反子mRNA（polycistron），即一条mRNA可编码几条肽链。无帽子结构和尾巴，不含稀有碱基，半寿期为13min，二级结构有丰富的自身回折产生的双链区.2.真核生物mRNA为单顺反子mRNA（monocistron），即一条mRNA只编码一条肽链。5有帽子结构，3有尾巴，含少量稀有碱基，半寿期可达1小时。四、rRNA的结构rRNA形成大量的双螺旋、突环、结合环等E.coli 5S rRNA二级结构E.coli16SrRNA二级结构1.一级结构（1）分子量25000左右；7399个核苷酸，大多数是76个核苷酸。（2）含有较多的稀有碱基（3）3端为CCA（4）5端磷酸化2.二级结构三叶草型五、tRNA的结构tRNA二级结构tRNA三级结构3.三级结构倒L型六、snRNA（smallnuclearRNA）分布于细胞核，80260个核苷酸，沉降系数48S。普遍存在于各种真核生物中。由于富含尿嘧啶，所以以U系列命名。功能：多样化，U1、U2、U4、U5、U6与蛋白质结合参与mRNA的剪接；U3与rRNA加工有关等。七、snoRNA(smallnucleolarRNA)存在于真核生物细胞核的核仁部分，有多种类型，功能为参与rRNA的加工，影响rRNA及其前体的形成指导甲基化位点的形成等。八、反义反义RNA（antisenseRNA）指能与mRNA进行互补结合的单链RNA。具有调节作用。一、具有催化活性RNA具有催化活性的具有催化活性的RNA称为核酶称为核酶(ribozyme)。现在已知核酶可分为以下几种类型：1剪接型核酶。剪接型核酶。剪接型核酶的作用机制是通过既剪又接的方式除去内含子，连接外显子，生成成熟RNA。又可分为类内含子的自我剪接和类内含子的自我剪接两型。第六节 具有催化活性的核酸2剪切型核酶剪切型核酶。自身催化剪切型RNA包括植物类病毒RNA、植物病毒的卫星RNA及肝炎病毒RNA等。这类RNA进行自身催化的反应是只切不接，特点是在Mg2+或其它二价金属离子存在下，在特定的位点自我剪切，产生5-OH和2，3-环磷酸二酯末端。异体催化剪切型RNA核糖核酸酶P（RNaseP）由M1RNA和蛋白质亚基组成，广泛分布于细菌、酵母、家蚕和哺乳动物组织中。能剪切所有tRNA前体的5端，除去多余的序列，在tRNA合成中起重要作用。蛋白质作为辅助因子。二、具有催化活性的DNA具有催化活性的具有催化活性的DNA称为脱氧核酶称为脱氧核酶（deribozyme）1.RNA切割作用以金属离子为辅因子Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+等；以氨基酸为辅因子如：L组氨酸；无辅助因子。2.DNA切割作用两类：I类脱氧核酶：需Cu2+和维生素C参加II类脱氧核酶：只需Cu2+参加3.过氧化物酶活性4.DNA激酶活性可使DNA5端磷酸化5.DNA连接酶活性