兽医学畜牧学遗传的物质基础.pptx
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1、第三章第三章 遗传的物质基础遗传的物质基础第一节 遗传物质的本质一、一、DNA是遗传物质是遗传物质(一)(一)DNA是遗传物质的证明是遗传物质的证明n1928年年Griffith等进行的肺炎球菌转化等进行的肺炎球菌转化(transformation)实验)实验.n1944年年Avery证明证明DNA是遗传物质是遗传物质.(二)(二)DNA携带两类不同的遗传携带两类不同的遗传信息信息1.负责基因结构的信息负责基因结构的信息2.负责基因选择性表达的信息负责基因选择性表达的信息二、二、RNA也可作为遗传物质也可作为遗传物质(一)(一)RNA病毒病毒病毒颗粒(病毒颗粒(viron):由病毒:由病毒RN
2、A基基因组和包被在外的蛋白质外壳组成因组和包被在外的蛋白质外壳组成.病毒的生存方式:病毒的生存方式:病毒编码包装基因病毒编码包装基因组所需的蛋白,以及一些在感染循环组所需的蛋白,以及一些在感染循环中复制病毒所需的蛋白质。其他蛋白中复制病毒所需的蛋白质。其他蛋白质由宿主提供。因此病毒不能独立生质由宿主提供。因此病毒不能独立生存。存。(二)类病毒(二)类病毒(viroid)类病毒类病毒:是使高等植物产生疾病的有传染是使高等植物产生疾病的有传染性的因子,由很小的环状性的因子,由很小的环状RNA分子构成。分子构成。与病毒不同,类病毒的与病毒不同,类病毒的RNA本身就是感染本身就是感染因子。类病毒只由因
3、子。类病毒只由RNA组成,其中广泛组成,其中广泛存在不完全的碱基配对,形成一种特有存在不完全的碱基配对,形成一种特有的棒状结构。类病毒的基因组不能编码的棒状结构。类病毒的基因组不能编码蛋白质。蛋白质。类病毒的复制:类病毒的复制:必须由宿主的酶来完成,必须由宿主的酶来完成,其其RNA作为模板。作为模板。类病毒对宿主的影响:类病毒对宿主的影响:类病毒可通过复制类病毒可通过复制占有宿主细胞中关键的酶,从而影响宿占有宿主细胞中关键的酶,从而影响宿主细胞的正常功能;类病毒也能影响必主细胞的正常功能;类病毒也能影响必需的需的RNA的产生而引发疾病;它们还可的产生而引发疾病;它们还可以作为一个不正常的调控分
4、子,对个别以作为一个不正常的调控分子,对个别基因的表达产生特殊的影响。基因的表达产生特殊的影响。三、是否存在核酸之外的遗传物质?三、是否存在核酸之外的遗传物质?(一)朊病毒(一)朊病毒(prion):):是一个是一个28KDa的疏水性糖蛋白,由细胞的疏水性糖蛋白,由细胞的核基因编码,在正常动物的脑组织中的核基因编码,在正常动物的脑组织中有表达。有表达。(二)朊病毒的存在形式:(二)朊病毒的存在形式:朊病毒以感染性形式(朊病毒以感染性形式(PrPSC),和非感,和非感染性形式(染性形式(PrPC)两种形式存在。)两种形式存在。(三)两种形式的朊病毒的异同:(三)两种形式的朊病毒的异同:PrPC
5、PrPSC功能功能:不详不详 导致退行性神经疾病导致退行性神经疾病分分 布:布:正常脑正常脑 被感染脑被感染脑抗蛋白酶性:抗蛋白酶性:可被完全降解可被完全降解 只能被部分降解只能被部分降解溶解性:溶解性:可溶可溶 难溶难溶 一级结构:一级结构:两者相同两者相同二级结构:二级结构:40%-螺旋螺旋 20%-螺旋,螺旋,50%-折叠折叠(四)朊病毒的感染方式(四)朊病毒的感染方式PrPSC 作用需要作用需要PrPC 的参与的参与PrPSC 蛋白的错误折叠形式可以催化蛋白的错误折叠形式可以催化天然天然PrPC分子从正常的可溶性的分子从正常的可溶性的 螺螺旋构象向不溶性的旋构象向不溶性的-折叠构象转化
6、,折叠构象转化,最终导致了疾病和感染。最终导致了疾病和感染。(五)朊病毒的多株现象(五)朊病毒的多株现象不同不同PrPSC株可使一种株可使一种PrP结构转化为不同的构结构转化为不同的构型;而同一种型;而同一种PrPSC可以在具有不同可以在具有不同PrP蛋白蛋白的多种生物中传代,即使经过多次传代仍然保的多种生物中传代,即使经过多次传代仍然保持自身的生物学特征。持自身的生物学特征。(六)朊病毒是遗传物质吗?(六)朊病毒是遗传物质吗?多株现象难以解释多株现象难以解释其感染方式能否被视为遗传复制?其感染方式能否被视为遗传复制?第二节 DNA的一级结构一、DNA一级结构的组成 一级结构:4种脱氧核苷酸的
7、连接及其排列顺序。(一)含氮碱基(含氮碱基(nitrogenous bases)胞嘧啶(cytosine,C)、胸腺嘧啶(thymine,T)、腺嘌呤(adenine,A)、鸟嘌呤(guanine,G)DNA中的常见碱基有:胞嘧啶(cytosine,C)、胸腺嘧啶(thymine,T)、腺嘌呤(adenine,A)和鸟嘌呤(guanine,G)(二)戊糖:核糖和脱氧核糖(三)脱氧核糖核苷(三)脱氧核糖核苷(nucleoside)由碱基和戊糖(D-脱氧核糖)缩合而成。有4种脱氧核糖核苷:胞嘧啶脱氧核糖核苷、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷和鸟嘌呤脱氧核糖核苷。+H2OH(四)脱氧核糖核苷
8、酸(四)脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷和磷酸缩合形成的磷酸酯(五)脱氧核糖核酸(五)脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)脱氧核糖核苷酸以3,5磷酸二酯键聚合成为脱氧核糖核酸(DNA)链。链的一端的核苷酸有自由的5磷酸基团,称5端;另一端核苷酸具有自由的3羟基,称3端。一个脱氧核苷一个脱氧核苷酸的酸的3端与下一端与下一个的个的5端通过磷端通过磷酸二酯键连接。酸二酯键连接。DNA链的方向就是从5端到3端。DNA分子通常以线性或环状的形式存在。大多数DNA由两条互补的单链构成。少数生物的DNA,如某些噬菌体或病毒是以单链形式存在的。二、序列测定方法(一)小片段重叠法(一)小
9、片段重叠法(二)凝胶直读法(二)凝胶直读法 1.酶法(1)加减法(Sanger,1975)(2)末端终止法(双脱氧法/间接拷贝法)(Sanger,1977)2.化学法(Maxam/Gilbert,1977)适用于DNA短片段的测定末端终止法的应用末端终止法的应用循环测序(循环测序(cycle sequecing)cycle sequecing)实验及原理实验及原理 a.a.测序反应的设定测序反应的设定体系中包括:体系中包括:DNADNA模板,模板,TaqDNATaqDNA聚合酶,寡核苷酸引物,聚合酶,寡核苷酸引物,4 4种种dNTPdNTP和荧光和荧光ddNTPddNTP(4 4种荧光)等种荧
10、光)等b.b.反应反应包括:包括:DNADNA变性,引物与模板配对,变性,引物与模板配对,DNADNA聚合酶使引物延伸(在引物聚合酶使引物延伸(在引物3 3末末端接上端接上dNTPdNTP或或ddNTPddNTP););c.c.反应的终止反应的终止20-3020-30个循环后,新合成所有可能的个循环后,新合成所有可能的DNADNA片段,每个片段的片段,每个片段的3 3末端都被接末端都被接上上ddNTPddNTP,延伸终止;,延伸终止;d.d.反应产物电泳分离及检测反应产物电泳分离及检测在聚丙烯凝胶中,不同大小的在聚丙烯凝胶中,不同大小的DNADNA片段在高压电场作用下迁移,小分子迁片段在高压电
11、场作用下迁移,小分子迁移速度快,先被位于凝胶底部的装置检测到。移速度快,先被位于凝胶底部的装置检测到。e.e.结果的处理及输出结果的处理及输出根据被检测到的根据被检测到的DNADNA片段的顺序及颜色,绘出片段的顺序及颜色,绘出DNADNA片段的电泳图谱。片段的电泳图谱。DNADNA序序列中的每个核苷酸由一系列按顺序排列的彩色峰型显示出来列中的每个核苷酸由一系列按顺序排列的彩色峰型显示出来双脱氧核苷三磷酸酶、4种dNTPddATP5TACGATCGTA35TACGA35TA3ddGTP5TACGATCGTATG35TACGATCG35TACG35TACGATCGTAT35TACGATCGT35T
12、ACGAT35T35TACGATC35TAC3ddTTPddCTPAGTCGTATGCTAGCAT3ATGCTAGCATAC553模板引物 三、一级结构的重要性 携带遗传信息决定DNA的二级结构决定DNA的空间结构第三节 DNA的二级结构 一、DNA螺旋的几种构象及其动态平衡(一)(一)Watson Crick右手双螺旋结构右手双螺旋结构 (B-DNAB-DNA构象)构象)相对湿度为92%时,DNA钠盐纤维为B-DNA构象。在天然情况下,绝大多数DNA以B构象存在。a.反平行双链右手螺旋b.糖Pi在螺旋线上c.碱基伸向内部其平面垂直于轴d.A=T、G=Ce.直径=2nm,一圈上升10对核苷酸,
13、螺距为3.4nmf.大沟(majorgroove)、小沟(minorgroove)WatsonCrick双螺旋结构模型特点:双螺旋结构模型特点:n(二)(二)A-DNA构象构象n为相对湿度改变(75%以下)或由钠盐变为钾盐、铯盐,DNA的结构可成为A构象。它是B-DNA螺旋拧得更紧的状态。DNA-RNA杂交分子、RNA-RNA双链分子均采取A构象。n(三)(三)Z-DNA构象构象n在一定的条件下(如高盐浓度),DNA可能出现Z构象。Z-DNA是左手双螺旋,磷酸核糖骨架呈Z字性走向。不存在大沟,小沟窄而深,并具有更多的负电荷密度。A-型B-型Z-型A-DNA、B-DNA和Z-DNA的一些结构特征
14、A-DNAB-DNAZ-DNA螺旋方向每圈螺旋的碱基数每一碱基对的上升距离螺距碱基对的倾斜度每一碱基对旋转的角度螺旋直径大沟小沟右手性110.255nm2.8nm20332.3nm窄而极深极宽而浅右手性10.40.34nm3.4nm6362.0nm宽而深窄而深左手性120.37nm4.5nm7-601.8nm平展极窄而深nB-DNA是活性最高的DNA构象,B-DNA变成A-DNA后,仍有活性,但若局部变构为Z-DNA后,活性明显降低。二、决定双螺旋结构状态的因素(一)氢键(一)氢键1.碱基的氢供体氨基、羟基2.碱基的氢受体酮基、亚氨基3.G-C对及A-T对之间的氢键:(在一定范围内DNA的稳定
15、性与G-C百分含量成正比)(二)碱基堆(二)碱基堆积力力1,碱基堆积力同一条链中的相邻碱基之间的非特异性作用力2,碱基堆积力的来源疏水作用力累积的Van der Waal的作用力3,碱基堆积作用的证据单链多核苷酸倾向于碱基平行排列的规则螺线结构破坏疏水作用和双链的氢键可降低DNA的稳定性Pu-PyPy-Pu碱基堆积形成积压碱基堆积形成积压Pu的双环结构,其的双环结构,其长度接近或超过螺长度接近或超过螺旋轴心旋轴心每对每对Bp又以又以propeller twist 形式存在形式存在相临两个相临两个Bp间的间的Pu发生过份的挤压导发生过份的挤压导致致Bp的抵牾的抵牾DNA分子的精细结分子的精细结构
16、发生改变,产生构发生改变,产生构象的不安定状态构象的不安定状态Pu的抵牾发生的抵牾发生在小沟一侧在小沟一侧Pu的抵牾发生的抵牾发生在大沟一侧在大沟一侧2倍抵倍抵牾力牾力TA不稳定不稳定GC稳定稳定(三)带电荷的磷酸基的静电斥力三)带电荷的磷酸基的静电斥力磷酸集团的负电对DNA双链的稳定性起负作用。阳离子可对之产生屏蔽。DNA溶液的离子浓度越低,DNA越不稳定。(四)碱基分子内能(四)碱基分子内能碱基内能越高,氢键和碱基堆积力越容易被破坏,DNA双链越不稳定第四节 DNA的三级结构 形成超螺旋的原因和条件:原因:因某种原因引入了额外的螺旋。条件:a,DNA双螺旋闭合或被蛋白结合,末端不能自由转动
17、;b,DNA双链上无断裂。一、一、超螺旋结构DNA的三级结构是指DNA双螺旋的进一步扭曲盘绕所形成的构象,主要表现为超螺旋结构。松弛态(relaxedstate):DNA中心轴与平面平行即不扭曲的状态。超螺旋:双螺旋结构的DNA再次扭曲形成的螺旋结构。a.右旋超螺旋负超螺旋(Negativesupercoil)b.左旋超螺旋正超螺旋(positivesupercoil)a.b.环状DNA分子的拓扑学性质 L=T+W W=L-T L L:连环数(Linking number)指一个封闭环状DNA双螺旋分子中的两条链彼此盘绕的次数;T T:双螺旋中转数(Twisting number,也叫螺圈数)
18、是双螺旋本身所有的性质。其数量等于碱基对总数除以每一圈的碱基对数(如:520010.4=500);W W:超螺旋数(Writhing number)。DNA的拓扑异构体:松弛型:W=0,L=T;负超螺旋:LT 例:动物病毒SV40的DNA(环状,含5200bp),在无超螺旋时,L=500,T=500,W=0;但实际上从细胞中分离出的SV40DNA含有25个负超螺旋,所以它的L=475,因此,L对一个DNA分子来讲是一个拓扑学特性,在不发生链的断裂时它是一个常数。(475=500-25)L=T+WW=L-T比连环差比连环差(Specific linking difference)(以表示)用来表
19、示超螺旋的程度;当初级螺旋数不变时,代表超螺旋密度。公式:=(L-L0)/L0(L0:表示松弛环型DNA的连环数)如一超螺旋DNA的L=23,L0=25,则=-0.08,大多数天然存在的DNA分子超螺旋密度在-0.03-0.09之间。超螺旋结构存在的意义密度大,体积小,在细胞中所占体积较为经济;超螺旋结构能影响双螺旋的解链程度,因而影响DNA分子与其它分子,如酶、蛋白质等分子的相互作用,参与DNA复制、重组、转录等重要功能。DNA的拓扑异构体可用凝胶电泳分开。n影响DNA高级结构的酶 L值的改变需要至少一条DNA链断裂一次。断裂造成的DNA自由末段的一断可绕着另一端旋转,随后被重新连接,DNA
20、拓扑异构酶通过催化此类反应将DNA从一种拓扑结构转变成另一种。l拓扑异构酶拓扑异构酶 (topoisomerase I,II)(topoisomerase I,II)参与构型的改变参与构型的改变功能比较拓拓扑扑酶酶功功能能比比较较TopI对负超螺旋处的对负超螺旋处的单链单链DNA具有极具有极强的亲合力强的亲合力TopII消除负超螺旋消除负超螺旋 松弛松弛B-DNA引入负超螺旋引入负超螺旋 紧缩紧缩B-DNAn1.I型型DNA拓扑异构酶拓扑异构酶底物:DNA单链ATP:不需 酶活性:DNA内切酶和连接酶活性代表:E.Coli的DNA拓扑异构酶I:可催化负超螺旋DNA转化为 松弛环型。鼠DNA拓扑
21、异构酶I:对正、负超螺旋有相同的松弛能力。原理:E.coli拓扑异构酶识别部分解螺旋的DNA分子,与DNA单链部分结合后,切断一条链,并以其酪氨酸残基与DNA的5磷酸相连。磷酸二酯键从DNA转移蛋白质上。酶将完整的DNA链拉过缺口后(L=+1),重新连接原先单链上磷酸二酯键。n上述过程除了改变DNA的超螺旋结构外,还可使单链环状分子形成三叶结构,以及使两个单链环状分子成为环连体分子。v2.II型型DNA拓扑异构酶拓扑异构酶n底物 DNA双链nATP 需要n酶活性 DNA内切酶和连接酶活性n代表 E.Coli旋转酶(DNA拓扑异构酶II),可引入负超螺旋。无ATP时,此酶只能缓慢地松弛负超螺旋。
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- 关 键 词:
- 兽医 畜牧学 遗传 物质基础
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