分离以尿素为氮源的微生物上课.pptx
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1、实验实验2 2分离分离以以尿素尿素为氮源的微生物为氮源的微生物此实验课题意义何在?此实验课题意义何在?1 1、尿素、尿素 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之之后才能被植物利用。后才能被植物利用。2 2、脲酶、脲酶土壤中的某些细菌能够合成土壤中的某些细菌能够合成脲酶,脲酶,并且并且向胞外分泌。向胞外分泌。CO(NHCO(NH2 2)脲酶脲酶+CO+CO2 2NHNH3 3+H+H2 2O O分离分离以以尿素尿素为氮源的微生物为氮源的微生物怎么怎么分离分离出能分解尿素的微生物
2、呢?出能分解尿素的微生物呢?菌种可能在什么环境中较多?菌种可能在什么环境中较多?实验室中微生物的筛选原理:实验室中微生物的筛选原理:人为提供人为提供促进促进目的菌株生长目的菌株生长的条件的条件(包括包括营养、温度、营养、温度、pHpH等等),同时,同时抑制或阻止抑制或阻止其他微其他微生物生物生长。生长。选择性培养基选择性培养基15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 4分离能够分解尿素的分离能够分解尿素的选择性
3、培养基选择性培养基成分:成分:从物理性质看此培养基属于哪类?从物理性质看此培养基属于哪类?固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源?在此培养基中哪些作为碳源、氮源?碳源:碳源:葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源:氮源:尿素尿素 培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素,只有能合成,只有能合成脲酶脲酶的微生物才能分解尿素,以尿素作的微生物才能分解尿素,以尿素作为氮源。为氮源。缺乏缺乏脲酶的微生物由于不能分脲酶的微生物由于不能分解尿素,缺乏氮源而不能生长发育繁殖,解尿素,缺乏氮源而不能生长发育繁殖,而受到抑制,所以用此培养基就能够选而受到抑制,所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。择出分解
4、尿素的微生物。培养基选择分解尿素的微生物的原理培养基选择分解尿素的微生物的原理?15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 4分离能够分解尿素的选择性培养基成分:分离能够分解尿素的选择性培养基成分:氮源真的唯一吗?氮源真的唯一吗?1、琼脂作为微生物固体培养基不可缺少的组成、琼脂作为微生物固体培养基不可缺少的组成 成分,其优点是:成分,其优点是:其主要成分不能被微生物利用;其主要成分不能被微生物利用;可使培养基可使
5、培养基固化固化;不影响不影响培养基中其他营养物质被微生物吸收。培养基中其他营养物质被微生物吸收。2、琼脂的成分、琼脂的成分 琼脂是一种未被纯化的混合物,主要成分为琼脂是一种未被纯化的混合物,主要成分为琼琼脂糖脂糖和和琼脂果胶,琼脂果胶,还含有少量的还含有少量的含氮化合物含氮化合物,及其,及其它有机杂质和不溶性杂质。它有机杂质和不溶性杂质。用用琼脂糖琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的固化剂代替琼脂作为微生物培养基的固化剂.尽可能使培养基中只含尽可能使培养基中只含尿素尿素一种含氮化合一种含氮化合物,以防止琼脂中的物,以防止琼脂中的含氮化合物含氮化合物被以尿素为氮被以尿素为氮源的细菌利用,有利于对这类
6、细菌的筛选。源的细菌利用,有利于对这类细菌的筛选。15.0g15.0g琼脂糖琼脂糖1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 4分离能够分解尿素的选择性培养基成分:分离能够分解尿素的选择性培养基成分:对培养基的灭菌方法?对培养基的灭菌方法?G6玻璃砂漏斗过滤玻璃砂漏斗过滤怎样证明此培养基具有选择性呢?怎样证明此培养基具有选择性呢?以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培养基的培养基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培养基培养基是是分离分离尿素尿素细菌细菌
7、判断该判断该培养基培养基有无选有无选择性择性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否是否接种接种目的目的结果结果只生长尿只生长尿素细菌素细菌生长多种生长多种微生物微生物是是选择培养基选择培养基分离分离土壤中分解尿素的微生物并土壤中分解尿素的微生物并计数计数.筛选菌株筛选菌株.分离出分离出单个菌落单个菌落并统计菌落数目并统计菌落数目.设置对照设置对照平板划线法平板划线法稀释涂布法稀释涂布法稀释涂布平板法稀释涂布平板法原理:原理:将样品进行将样品进行稀释稀释,在稀释度足够高时,在稀释度足够高时,微生物在固体培养基上能形成微生物在固体培养基上能形成单个菌落单个菌落。所形成的所形成的一个菌落一
8、个菌落是由是由一个单细胞一个单细胞繁殖而成繁殖而成的,即的,即一个菌落代表原先的一个单细胞。一个菌落代表原先的一个单细胞。实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右,再取样,将样品装入事先左右,再取样,将样品装入事先灭菌灭菌好的信好的信封中。封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。.制备培养基:制备培养基:制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择性培养基选择性培养基。制备基础培养基。制备基础培养基。应在火焰旁称取土壤应在火
9、焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程中,每一步都要在在稀释土壤溶液的过程中,每一步都要在火焰旁进行火焰旁进行 三三 样品的稀释样品的稀释移液枪(微量可调移液管)移液枪(微量可调移液管)注意事项注意事项为使结果接近真实值将同一稀释度加到为使结果接近真实值将同一稀释度加到为使结果接近真实值将同一稀释度加到为使结果接近真实值将同一稀释度加到三个或三个三个或三个三个或三个三个或三个以上以上以上以上的平皿中,经涂布,培养计算出菌落的平皿中,经涂布,培养计算出菌落的平皿中,经涂布,培养计算出菌落的平皿中,经涂布,培养计算出菌落平均数平均数平均数平均数。为了保证结果准确,一般选择菌落数在为了保证结
10、果准确,一般选择菌落数在为了保证结果准确,一般选择菌落数在为了保证结果准确,一般选择菌落数在30303030300300300300的平的平的平的平板上进行计数。板上进行计数。板上进行计数。板上进行计数。如果得到了如果得到了如果得到了如果得到了2 2个或个或个或个或2 2个以上个以上个以上个以上菌落数目在菌落数目在菌落数目在菌落数目在3030030300的平板,则说明稀释操作比较成功,并能够进的平板,则说明稀释操作比较成功,并能够进的平板,则说明稀释操作比较成功,并能够进的平板,则说明稀释操作比较成功,并能够进行菌落的计数,如果行菌落的计数,如果行菌落的计数,如果行菌落的计数,如果同一稀释倍数
11、的三个重复的菌落同一稀释倍数的三个重复的菌落同一稀释倍数的三个重复的菌落同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大,表明试验不精确数相差较大,表明试验不精确数相差较大,表明试验不精确数相差较大,表明试验不精确,需要重新实验。,需要重新实验。,需要重新实验。,需要重新实验。统计的菌落往往比活菌的统计的菌落往往比活菌的统计的菌落往往比活菌的统计的菌落往往比活菌的实际数目低实际数目低实际数目低实际数目低。分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度稀释倍数稀释倍数目的目的细菌细菌10104 4、10105 5、10106 6保证获得菌落保证获得菌落数在数在3030300300之间、适
12、于计之间、适于计数的平板数的平板放线菌放线菌10103 3、10104 4、10105 5真菌真菌10102 2、10103 3、10104 4原因:不同微生物在土壤中含量不同原因:不同微生物在土壤中含量不同实验中提供的选择培养基的配方中,实验中提供的选择培养基的配方中,尿素是培养基中的尿素是培养基中的惟一氮源惟一氮源,因此,原则,因此,原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。但实际上,微生物的培养是一个非常复杂但实际上,微生物的培养是一个非常复杂的问题,有些微生物可以利用其他微生物的问题,有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖,因此能够在选择培
13、的代谢产物生长繁殖,因此能够在选择培养基上生长的微生物不一定是所需要的微养基上生长的微生物不一定是所需要的微生物,还需要进一步的验证。生物,还需要进一步的验证。在在实验中,实验中,酚红酚红作为酸碱指示剂被添加到作为酸碱指示剂被添加到了培养基中,其变色范围是了培养基中,其变色范围是pH6.4pH6.48.28.2,在酸,在酸性情况下呈性情况下呈黄黄色,碱性情况下呈色,碱性情况下呈红红色,这种添色,这种添加了酸碱指示剂的培养既可以加了酸碱指示剂的培养既可以鉴鉴别和分离别和分离出能出能够产生脲酶分解尿素的微生物,称为够产生脲酶分解尿素的微生物,称为鉴别培养鉴别培养基基。尿素在被脲酶催化分解前是尿素在
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