影响PCR扩增因素的分析.pdf
《影响PCR扩增因素的分析.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《影响PCR扩增因素的分析.pdf(5页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、影响影响 PCR 扩增因素的分析扩增因素的分析 摘要摘要:PCR 的发展可以说是从 DNA 合成酵素的发现缘起。DNA 合成酵素最早于 1955 年发现(DNA polymerase I),而较具有实验价值及可得性的 Klenow fragment of E.Coli 则是于 70 年代的初期由 Dr.H.Klenow 所发现,但由于这个酵素是一种易被热所破坏之酵素,因此不符合一连串的高温连锁反应所需。随着经济的全球化,PCR 技术的广泛应用,研究 PCR 技术的影响因素闲的愈来愈重要。关键词关键词:多聚酶链式反应 PCR 扩增技术 多重 PCR 1 1PCRPCR 技术的原理技术的原理 PC
2、R 技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成:模板 DNA 的变性:模板 DNA 经加热至 93左右一定时间后,使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;模板 DNA 与引物的退火(复性):模板 DNA 经加热变性成单链后,温度降至 55左右,引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合;引物的延伸:DNA 模板-引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下,以 dNTP 为反应原料,靶序列为模板,按 碱基互补配对与半保留复制原理,
3、合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链,重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24 分钟,23 小时就能将待扩 目的基因扩增放大几百万倍1。聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction,PCR),又称无细胞克隆技术(FreeBacteria Cloning Technique),是一种根椐生物体内 DNA 复制的某些特点而设计的,在体外对特定 DNA 序列进行快速扩增的技术。2 2PCRPCR 技术的发展技术的发展2.12.1 常规常规 PCRPCR 检测检测对细菌进行分类鉴定的常规 PCR
4、技术,主要是以高度保守的特定基因序列的基础上建立起来的,如核糖体 RNA(rDNA)、gyrB 基因、toxR 基因等。自6O 年代末,Woese 首次运用 rDNA 分析生物的系统发育以来,rDNA 数据库快速扩大,已成为细菌多样性、系统进化与发育研究广泛采用的序列。细菌的16SrDNA 基因核苷酸序列具有高度保守性,它的序列变化与进化距离相适应,被称为一种进化分子钟。由于其进化速度大约是每五千万年发生 1的碱基变化,所以适用于种以上水平的鉴定。研究细菌 16SrDNA 最直接的方式就是通过基因测序并与 Genbank、EMBL、DDB 等国际通用的数据库比对,根据同源性的大小确定细菌种的归
5、类。23SrDNA 基因也是非常保守的序列,由于它与16SrDNA 基因是线性串联排列,在此基础上就发展出利用 16S-23SrDNA 基因间区序列来对细菌进行鉴定的方法。这个基因区段的进化速度高于 16S rDNA,因此可以发展成为细菌种甚至株的鉴定方法。除此以外,还有其它一些高度保守的序列,如 gyrB 基因(细菌中广泛存在的一种编码 DNA 的拓扑异构酶的 B 亚基的单拷贝基因)、toxR 基因(弧菌中的毒素表达调控蛋白基因)等也越来越广泛的被用于对病原性细菌进行分子生物学鉴定。2.22.2 多重多重 PCRPCR 技术技术多重 PCR 技术是在常规 PCR 基础上改进并发展起来的一种新
6、型 PCR 扩增技术,其检测原理与传统 PCR 相同.如果存在与各引物对特异性互补的模板,只不过是在同一反应体系中加入 1 对以上的特异性引物,那么就可以同时在同一个反应管中扩增出 l 条以上的目的 DNA 片段。使用这一方法可以同时检测 1 个以上目的基因或者借助其交叉限制进行确认。,可同时检测多种病原微生物。该技术自 1988 年 Chamberlain 首次应用于杜氏营养不良症(Duchenne musculardystrophy)基因外显子缺失的检测以来,已经在遗传病诊断、转基因鉴定、病原体检测等各个领域成功的得到应用。23.3.影响影响 PCRPCR 技术的因素研究进展技术的因素研究
7、进展 3.1 PCRPCR 扩增影响因素初探扩增影响因素初探多聚酶链式反应(Polymerase chain reaction)简称PCR技术,是一种体外扩增特异DNA 片段的技术,此法操作简便,可在短时间内获得数百万个特异性DNA序列的拷贝。影响PCR 反应结果的因素较多,其中如何获得高质量的基因组DNA 模板以及PCR 反应体系中各种成分因子的优化组合,是获得清晰可重复的扩增产物的前提,也是扩增反应能否成功的关键。3为保证反应结果的稳定性和可靠性,同时降低反应成本,必须系统地探讨基因组中DNA 的PCR反应体系中各种因素对扩增结果的影响,对PCR 进行优化,以期为目地基因PCR 反应成功提
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 影响 PCR 扩增 因素 分析
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【丰****】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【丰****】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。