小果型西瓜四倍体诱变及其鉴定分析_罗晓丹.pdf

试验研究 2023.1小果型西瓜材料普遍品质佳、糖度高，但是存在不同程度的抗性差、皮薄、不耐贮运的特点。通过多年杂交育种，虽然在一定程度上改变了其抗性和贮运性，但品质却难以改善。多倍体植株与正常倍性植株相比通常会表现出营养物质增多、贮运性好、抗病性和抗逆性提高等特点，在植物育种领域受到广泛应用。刘文革等对不同倍性西瓜的耐盐性、耐淹性及预冷处理后的耐冷能力等进行测定，都得出了多倍体西瓜高于二倍体西瓜的结论1-2。开封地区种植西瓜有多年历史,是我国有名的西瓜产区,近年来所培育的西瓜品种品质难以突破,且抗病性差。利用不同浓度的秋水仙素诱变获得四倍体植株是多倍体育种的一个重要途径，已经在西瓜和甜瓜等瓜类作物的多倍体育种中得到了应用3。本文作者通过在组织培养环境下添加不同浓度秋水仙素得到西瓜四倍体，为西瓜新品种的选育提供理论依据和实践指导。1材料与方法1.1试验材料试验材料为开封327小果型西瓜种子，由开封市农林科学研究院自行培育获得。该试验于2019年7月至2021年7月在开封市生物育种重点实验室完成。1.2试验方法1.2.1活体诱变（1）滴液法。西瓜种子播种于育苗盘中,待出2片真叶时,将蘸有秋水仙素溶液的脱脂棉球（棉球重0.02 g）放在两真叶中间生长点上,每天于8:00和18:00各滴加秋水仙素溶液1次,以药液浸透脱脂棉球为宜,在育苗盘上方扣纸箱3 h达到遮光效果。秋水仙素溶液处理浓度分别为0.2%、0.3%、0.4%,处理时间为2 d、4 d、6 d,到时间后,去掉脱脂棉球,并用蒸馏水冲洗植株处理部位3遍,上方搭遮阳网，防止缓苗期灼伤。每个处理30株苗,每个处理3次重复,以蒸馏水的处理作为对照。（2）涂抹法。将配置好的1/2MS培养基取适量和秋水仙素混合均匀,配成浓度为0.2%、0.3%、0.4%的均匀混合物,待培养基凝固后,将培养基直接涂抹到西瓜幼苗的生长点上,处理时间为2 d、4 d、6 d,到时间后,用清水反复冲洗35遍,将琼脂冲洗干净。每个处理30个幼苗,每个处理重复3次,以不含秋水仙素的培养基作为对照。1.2.2离体诱变（1）西瓜无菌种子及无菌苗的获得。选取籽粒饱满、大小均匀一致的西瓜种子，在超净工作台上用75%乙醇表面消毒30 s，然后置于0.1%HgCl2溶液中消毒10 min，无菌蒸馏水冲洗35遍，即获得无菌小果型西瓜四倍体诱变及其鉴定分析罗晓丹1，2霍治邦1侯晟灿1程志强1范君龙1（1.开封市农林科学研究院河南开封475004；2.开封市生物育种重点实验室河南开封475004）摘要：以开封327小果型西瓜为母本，以实生苗为试验材料,在组织培养环境下用不同浓度的秋水仙素处理西瓜种子、茎尖生长点等,用形态学显微镜对茎尖细胞染色体数目的加倍效果进行鉴定，并对处理后西瓜的幼苗成活率和变异率进行统计,其中采用浸种法处理的诱变率达到66.7%，效果良好，为改良优质二倍体小果型西瓜提供了新方法，也为开展无籽西瓜新品种的选育提供了试验材料。关键词：小果型西瓜；秋水仙素；诱变；四倍体基金项目：国家西甜瓜产业技术体系(CARS-25)。作者简介：罗晓丹（1983-），女，硕士，助理研究员，从事西瓜遗传育种研究。E-mail：通讯作者：程志强（1972-），男，硕士，副研究员，从事西甜瓜遗传育种研究。E-mail：135-2023.1 试验研究西瓜种子。用无菌滤纸将消过毒的种子吸干表面的水分，接种到无激素的1/2 MS培养基上，培养期间需遮光处理3d，待种子破壳发芽，芽长1.5 cm以上后转人工全日光下培养，光照周期为16 h/d，光照度为2 500 1x，培养期间保证组培室温度在（251），30 d即可获得无菌实生苗，为下一步的诱变工作提供材料。试验中每处理接种6瓶，每瓶接种6粒种子。（2）秋水仙素诱变处理。西瓜种子诱变处理。根据西瓜种子发芽率高、发芽时间短的特征，本试验采用药剂培养基法，在种子灭菌后，直接接种于含有秋水仙素的固体培养基中，秋水仙素质量浓度为0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%，同时以未添加秋水仙素的培养基作为对照。光照周期为16 h/d，光照度为2 500 lx，培养期间保证组培室温度在（251）。试验中每处理接种3瓶，每瓶接种6粒种子。25 d后观察统计不同秋水仙素浓度对诱变率及成活率的影响。西瓜叶片、茎段诱变处理取上述培养的西瓜种子无菌实生苗子形态学上端往下数第24对叶的叶片，剪取叶缘，剪成0.5 cm0.5 cm的小块，茎段剪成0.51.0 cm长的小段，分别放置于愈伤组织诱变培养基，于光照周期为16 h/d、光照度为2 500 1x、温度为（251）的条件下进行预培养，培养15 d，滴加浓度0.2%、0.3%、0.4%、0.5%秋水仙素无菌水溶液进行诱变处理，在黑暗条件下连续滴加1 d、3 d、5 d，每天2次，处理结束后转入人工培养室培养。试验中每个处理接种3瓶，每瓶接种4个外植体，重复3次。芽生根培养及植株再生。西瓜种子诱变处理结束后，将发芽种子转入1/2 MS培养基。叶片、茎段诱变处理的，将长至2 cm左右的不定芽转接到MS+1.0 mg/L NAA的培养基中诱变不定芽生根以形成完整植株。1.2.3多倍体植株的鉴定（1）形态学鉴定。取实生苗苗龄30 d的四倍体西瓜植株叶片和无菌实生苗二倍体植株叶片，比较同时期、同结位叶片的叶形、叶色等形态学差异，用游标卡尺测量叶片的长宽，计算长宽比，每个样本测30个叶片，取平均值。（2）气孔鉴定。取实生苗苗龄30 d的四倍体西瓜植株叶片和无菌实生苗二倍体植株叶片，按照叶片大小进行排列，取同样大小的叶片，将植物叶片背面朝上，在叶背面均匀涂抹一层指甲油，等数分钟后把干的指甲油撕下，放置于载玻片上，在显微镜40物镜下观察并记录各叶子保卫细胞气孔的数目，测量保卫细胞的长宽比，利用摄相机拍下所观察到的影像，并存于电脑中。分别选取30个保卫细胞进行气孔、保卫细胞指标测定4-5。（3）染色体鉴定。参照舒寿兰法。剪取1.01.5 cm茎尖放入盛有0.003 mol/L 8-羟基哇琳水溶液的医用密封小瓶中,常温下预处理3.05.0 h，取出预处理后的材料,用蒸馏水清洗35遍,转入卡诺固定氏液中固定24 h以上，用95%乙醇清洗材料23遍后转入70%乙醇中保存。制片前,用蒸馏水将材料清洗一遍,转入1 mol/L的盐酸中,在60恒温水浴锅里离析8 min，再用蒸馏水清洗茎尖23遍,最后放在载玻片上,用解剖刀截取约0.5 mm长的茎尖,滴上1滴卡宝品红染色液，染色3060 min,加盖玻片后用滤纸吸取多余的染色液,用铅笔头轻轻、均匀地敲打盖玻片使细胞铺成薄薄的一层,制成临时压片,在火镜头下观察染色体条数,并选择染色效果好、染色体分散均匀的细胞进行拍照。每个临时压片观察30个分裂中期细胞。1.2.4统计方法数据处理采用Excel 2007进行数据统计、作图，采用SPSS 17.0软件进行数据统计分析。存活率=（存活的外植体个数/接种外植体总数）100%四倍体诱变率=（诱变出四倍体的个数芽数/总存活数）1002结果与分析2.1活体诱变处理方法对诱变效果的影响2.1.1滴液法诱变西瓜多倍体由表1可知，在滴液法诱变西瓜四倍体试验中，随着处理浓度的增大，植株药害影响增大，死亡率差异明显，在相同的处理天数，其死亡率随浓度增加而增大；理论上处理时间越长，浓度越大，诱变率越高，当浓度达到0.4%时，药害明显，植株生长停滞，生长点枯死等问题突出。秋水仙素浓度为0.3%，处理4 d，诱变率为5.89%，相对较高，但仍不理想。2.1.2涂抹法诱变西瓜多倍体由表2可知,涂抹法诱变西瓜多倍体试验与滴液法原理类似，秋水仙素与培养基混合后，可以最大限度地保持湿度，保证处理效果。秋水仙素浓度为0.2%时，植株成活率高，但诱变率低;秋水仙素浓度为0.4%时,植株由于药害作用，成活率下降，从而影响整体诱变率，植株生长缓136-试验研究 2023.1慢，出现不定侧芽，植株矮小化，后期嵌合体较难分离，植株再生体系建立效果差。秋水仙素浓度为0.3%,处理4 d时,植株成活率较高，诱变率6.67%，获得的变异植株最多。2.2离体诱变西瓜四倍体2.2.1西瓜种子诱变处理随着培养基中秋水仙素浓度的增加，实生苗成活率显著下降，同时诱变率也随着浓度增加而提高，但是当秋水仙素浓度达到最大值0.9%时，苗出现畸形、矮化、早衰等现象。从试验数据观察可得（表3），秋水仙素浓度为0.6%0.7%时诱变率最高，达到66.7%，但是这个组合实生苗成活率较低，成苗后均有不同程度的节间缩短、矮化；秋水仙素浓度为0.4%0.5%时成活率达到83.3%，诱变率为43.7%，综合诱变效果较好。2.2.2西瓜叶片、茎段诱变处理不同处理时间的叶片、茎段诱变效果有较大差异（表4），处理1 d，成活率高，植株再生效果好，但是诱变率低，秋水仙素浓度为0.5%的诱变率仅有33.3%；处理2 d，诱变率明显提高，秋水仙素浓度变化后植株诱变率差异不大，秋水仙素浓度为0.2%的成活率最高，诱变效率相对适宜；处理3 d，植株药害严重，成活率低，植株再生出芽率更低，诱变率并无提高。2.3不同处理方法诱变效率统计分析通过显著性分析可知（表5），不同处理方法对诱变率有显著性影响，种子诱变处理的诱变率最高，离体诱变整体效率较活体诱变高。3讨论与结论本试验通过活体处理、种子无菌处理、实生苗叶片、茎段处理，设计不同药剂处理时间、处理浓度，初步探讨了诱变机理。活体滴液法和涂抹法处理小果型西瓜幼苗，操作简单，处理量大，但是在处理过程中，液体蒸发快，光照会加快秋水仙素的分解，降低表1滴液法对诱变效果的影响试验编号处理数量（个）处理时间（d）秋水仙素浓度（%）成活率（%）诱变率（%）19020.272.30a0.60d29040.255.56b1.11cd39060.257.77ab1.11cd49020.354.37b3.23b59040.345.71c5.89a69060.333.28cd2.22c79020.425.14cd1.11cd89040.426.11cd0d99060.415.16d2.22c10（CK）90601000表2涂抹法对诱变效果的影响试验编号处理数量（个）处理时间（d）秋水仙素浓度（%）成活率（%）诱变率(%）19020.286.67a0d29040.273.15ab0.50d39060.257.77b1.11c49020.354.37b3.23b59040.345.71bc6.67a69060.333.28c2.22bc79020.425.14cd1.11c89040.426.11cd0d99060.415.16d2.22bc10（CK）90601000137-2023.1 试验研究表5不同处理方法对诱变效率统计分析指标活体诱变离体诱变滴液法涂抹法种子诱变处理叶片、茎段处理成活率（平均）42.82d46.37c71.60a61.35b诱变率（平均）1.94c1.89d33.93a25.94b其浓度，小剂量处理效果较差。由于较大浓度秋水仙素的剧毒作用，对整个植株生长影响较大，抑制不定芽分化，嵌合体较多，因此诱变率低。离体诱变，在组织培养环境下，能够精准控制浓度和用量，受外界环境影响小，后期植株再生时，由于秋水仙素的抑制作用，不定芽分化慢，极易导致外植体死亡，这在前人的研究中也有出现68。根据西瓜种子发芽容易、种皮易破的特点，设计种子浸泡处理法，从中发现种子处理较其他几种方式相对快速，且嵌合体少，处理结束转入不含秋水仙素的培养基进行植株再生体系建立，植株药害轻，不影响后期生长，可以快速得到纯合四倍体，这为无籽小果型西瓜育种中获得纯合稳定材料大大缩短了育种年限。但是成苗后部分植株矮化、早衰等问题还需表3种子诱变对诱变效果的影响试验编号处理数量（个）处理时间（d）秋水仙素浓度（%）成活率（%）诱变率(%）118720.05100.0a0d218720.1100.0a0d318720.294.4a29.4d418720.394.4a35.3cd518720.483.3b37.5c618720.583.3b43.7b718720.655.6bc66.7a818720.750.0c66.7a918720.827.8d60.0ab1018720.927.8d0dCK1875201000表4叶片、茎段诱变处理对诱变效果的影响试验编号处理数量（个）处理时间（d）秋水仙素浓度（%）成活率（%）诱变率(%）13610.2100.0a0d23610.375.0a20.8bc33610.477.8a18.2c43610.561.1ab33.3b53630.280.6a41.4a63630.363.9ab43.4a73630.455.6b41.2a83630.547.2c35.3b93650.261.1b22.7bc103650.344.4c25.0bc113650.441.6c20.0bc123650.527.9d10.0d138-试验研究 2023.1继续反复试验，查找原因,建立完整的植株再生体系。参考文献1刘文革，王鸣,阎志红.不同倍性蜜枚西瓜幼苗在低温胁迫下的生理生化特性J.果树学报，2001，20（1）：44-48.2徐洪国,宣杨,仲娟娟,等.小果型西瓜子叶节离体培养J.中国瓜菜,2018,31（3）:38-40.3罗晓丹，朱延林.秋水仙素在木本植物多倍体育种中的应用进展J.林业科技通讯，2009，3（1）：3-5.4羊杏平,陈学好,张朝阳,等.无籽西瓜茎尖不定芽诱导和增殖的影响因子J.江苏农业学报,2010,26（3）:567-571.5Abdollahi M.R.,Darbandi M.,Hamidvand Y.,et al.The influ-ence of phytohormones,wheat ovary co-culture,and tempera-ture stress on anther culture responseof watermelon（Citrullus-lanatus L.）J.Brazilian Journal of Botany,2015,38（3）:447-456.6田恩堂,贺朱林,周平,等.植物多倍体的形成及其二倍化机制J.湖北农业学,2017（11）:2001-2007.7刘茜,余磊磊,聂倩文,等.荆半夏多倍体新种质诱导研究J.长江大学学报（自然科学版）,2018,15（10）:28-33.8张虹,刘祥,虎娟,等.甜叶菊多倍体诱变J.分子植物育种,2017,15（3）:1010-1013.9武娅歌,赵建华,宋晓飞,等.欧洲温室型黄瓜同源四倍体新种质的创制与鉴定J.江苏农业科学,2019,47（18）:141-145.10李伟强,戴晓港,李小平,等.美洲黑杨种质材料倍性鉴定J.南京林业大学学报（自然科学版）,2019,43（5）:51-58.磷是是植物生长所必需的大量元素之一，在包括光合作用和呼吸作用等几乎所有的主要代谢过程中起着非常关键的作用1-2。植物体内的磷含量相差很大，占植株干重的0.2%1.1%3，此外磷也是ATP、NADPH、核酸、磷脂等重要生物大分子的关键组成元素。尽管磷元素在土壤中储量丰富，但大部分磷与土壤中的钙、镁、铁、铝结合形成难溶的磷酸盐，因而不能被植物根系直接吸收。能够被植物直接吸收的磷素是H2PO4-和HPO42-形态的磷，而施入的磷在碱性土壤中，磷氧化物与钙结合形成难容的钙盐，在酸性土壤中与铁和铝形成难溶的铁盐和铝盐4-5，故虽然土壤中磷的含量丰富，但是可以被植物直接利用的有效磷含量却很低。同时土壤固定磷的能力有限，大部分施入农田的磷肥随着雨水或地表径流等进入湖泊、河流等水体，造成水体富营养化，长期以来给环境造成巨大压力6。大葱（Allium fistulosum L.）是石蒜科葱属的一种蔬菜，在全国各地均有种植，主要产区分布在山东、大葱苗期耐低磷品种的筛选基金项目：河北省重点研发计划项目（20326905D）；国家特色蔬菜产业技术体系（CARS-24-B-04）；农业农村部园艺作物生物学与种质创制重点实验室。作者简介:吕立军(1992-)，男，硕士在读，从事蔬菜栽培研究研究。E-mail：通讯作者：贺超兴（1965-），男，研究员，从事特色蔬菜产地环境研究。E-mail：吕立军1安进军2袁瑞江2李衍素1闫妍1王君1贺超兴1（1.中国农业科学院蔬菜花卉研究所北京100081；2.石家庄市农林科学研究院河北石家庄050041）摘要：为筛选苗期耐低磷的大葱品种，找到快速评价大葱苗期耐低磷能力的指标，以减少磷肥施用。本试验选用24份大葱材料，采用正常的1 mmol/L磷素水平和低磷的0.2 mmol/L磷素水平的1/2 Hoagland营养液进行了水培处理，对大葱苗期耐低磷能力进行了综合评价，以期为大葱苗期耐低磷性鉴定提供参考。结果表明，24份大葱材料对低磷环境的反应存在程度不同的差异。根据耐低磷性将供试材料分为3类，冀葱1号品种为耐低磷型品种；辽葱16-12、铁杆梧桐王和烧葱等3个品种为低磷敏感的不耐低磷品种；酒井大葱、旱葱1号、独根巨葱、鲁葱杂5号、巨葱王、天明一本、日本冬悦和元藏等20个品种为中度耐低磷型品种。筛选出根干重相对值、根鲜重相对值、根冠比相对值、叶长相关值、地上部鲜重相对值和茎粗相对值可作为大葱苗期耐低磷的鉴定指标。关键词：大葱；苗期；耐低磷性；综合评价；鉴定指标；品种筛选139-