皂荚种子发芽期间酶活及多糖结构与流变性质的比较研究_裴滢莹.pdf

第 43 卷第 1 期2023 年 2 月林产化学与工业Chemistry and Industry of Forest ProductsVol 43 No 1Feb 2023收稿日期:2021-11-08基金项目:国家重点研发计划资助项目(2016YFD0600803);国家大学生创新计划(G202010022186)作者简介:裴滢莹(2000)，女，广东潮州人，本科生，主要从事植物提取物与功能糖的研究工作*通讯作者:蒋建新，教授，研究领域:林产化工与生物质能源材料;E-mail:jiangjx bjfu edu cn。doi:10 3969/j issn 0253-2417 2023 01 017皂荚种子发芽期间酶活及多糖结构与流变性质的比较研究PEI Yingying裴滢莹1，徐 伟1，裴昕斐然1，段久芳1，陈殿松2，蒋建新1*(1北京林业大学 材料科学与技术学院;林业生物质材料与能源教育部工程中心，北京 100083;2广州德谷个人护理用品有限公司，广东 广州 510880)摘要:分别在 25 和 35 下模拟皂荚种子发芽过程，对比研究不同发芽时间下皂荚胚芽子叶和内胚乳内-D-半乳糖苷酶的酶活及皂荚半乳甘露聚糖的分子质量、单糖含量和流变特性等理化性质。结果表明:25 时皂荚内胚乳内-D-半乳糖苷酶的酶活在 3 45 5 78 U/g 上下波动(发芽第2 8 天)后迅速增加至 86 12 U/g(发芽第14 天)，35 时皂荚内胚乳内-D-半乳糖苷酶的酶活在3 31 9 24 U/g 之间上下波动。皂荚胚芽子叶内-D-半乳糖苷酶的酶活大多高于内胚乳内-D-半乳糖苷酶的酶活。种子发芽前期，较高发芽温度(35)更有利于半乳甘露聚糖的降解。随着发芽时间的延长，皂荚半乳甘露聚糖的分子质量和表观黏度逐渐降低，25 下溶液在第 12 天从假塑性流体转变为牛顿流体;皂荚半乳甘露聚糖中甘露糖和半乳糖的含量逐渐降低，甘露糖与半乳糖质量比值(M/G 值)逐渐增加，35 发芽第 14 天 M/G 值达到最大值为 3 31，有望成为价格昂贵的刺槐豆胶半乳甘露聚糖的替代产品。关键词:皂荚半乳甘露聚糖;种子发芽;-D-半乳糖苷酶;分子质量;流变特性中图分类号:TQ35;O629 12文献标志码:A文章编号:0253-2417(2023)01-0133-07引文格式:裴滢莹，徐伟，裴昕斐然，等 皂荚种子发芽期间酶活及多糖结构与流变性质的比较研究J 林产化学与工业，2023，43(1):133139Comparison on Enzymatic Activity，Polysaccharide Structure and heologicalProperties of Gleditsia sinensis Lam Seeds During GerminationPEI Yingying1，XU Wei1，PEI Xinfeiran1，DUAN Jiufang1，CHEN Diansong2，JIANG Jianxin1(1College of Materials Science and Technology，Beijing Forestry University;Engineering esearch Center of Forestry BiomassMaterials and Energy，Beijing 100083，China;2Guangzhou Degu Personal Care Products Co，Ltd，Guangzhou 510880，China)Abstract:The germination process of Gleditsia sinensis seeds was simulated at 25 and 35，respectively The activity of-D-galactosidase in cotyledon and endosperm，the molecular weight，monosaccharide content and rheological properties of G sinensisgalactomannan were studied at different germination times The results showed that at 25，the activity of-D-galactosidase inthe endosperm of G sinensis fluctuated from 3 45 to 5 78 U/g(2 8 days after germination)，and then rapidly increased to86 12 U/g(14 days after germination)At 35，the activity of-D-galactosidase in the endosperm of G sinensis fluctuatedfrom 3 31 to 9 24 U/g The-D-galactosidase enzyme activity in cotyledon of G sinensis was higher than that in endosperm Atthe early germination stage，the higher germination temperature(35)was more conductive to the degradation of galactomannanWith the prolongation of germination time，the molecular mass and viscosity of G sinensis galactomannan gradually decreased，and the solution changed from pseudoplastic fluid to Newtonian fluid on day 12 at 25 The contents of mannose and galactosein G sinensis galactomannan decreased gradually with the extension of germination time，and the mass ratio of mannose togalactomannan(M/G value)increased gradually The M/G reached the maximum value of 3 31 on the 14th day of germination at134林产化学与工业第 43 卷35，which was expected to be a substitute product for expensive locust bean gum galactomannanKey word:Gleditsia sinensis galactomannan;seeds germination;-D-galactosidase;molecular weight;rheological properties皂荚(Gleditsia sinensis Lam)为乔木，其种子主要由种皮、内胚乳和胚芽子叶组成，内胚乳中含有67%83%的半乳甘露聚糖1 4。半乳甘露聚糖来源广泛、资源丰富，具有极大的开发价值和应用潜力3，5。半乳甘露聚糖结构主要由-1，4-糖苷键连接的 D-吡喃型甘露糖主链和-1，6-糖苷键连接的 D-吡喃型半乳糖侧链残基组成2。半乳甘露聚糖在较低浓度下能形成高黏度的稳定性水溶液，因此常作为增稠剂、乳化剂和黏合剂被应用于纺织印染、兵工炸药、建筑涂料等行业3，5。甘露糖与半乳糖质量比值(M/G)是决定半乳甘露聚糖理化性质的重要因素。此外，半乳甘露聚糖的物理化学性质，特别是黏度主要受其分子质量的影响。目前，关于皂荚半乳甘露聚糖的研究主要集中在其结构、性质和检测方法 2，4 6。鲜见关于半乳甘露聚糖在皂荚种子发芽过程中理化性质的比较研究。通过对皂荚半乳甘露聚糖进行化学法和酶法改性，能够改变其结构与性质，从而实现皂荚半乳甘露聚糖的高值化利用 7。与化学法相比，酶法具有反应条件温和、环境污染小、反应过程和降解产物分子质量分布易于控制等优点 8。eid 等 9 研究发现:在皂荚种子发芽过程中，内切-D-甘露聚糖酶、-D-甘露糖苷酶和-D-半乳糖苷酶共同参与了半乳甘露聚糖的降解。其中，-D-半乳糖苷酶主要负责断裂半乳甘露聚糖中-1，6-糖苷键连接的半乳糖侧链，进而使半乳糖残基脱落下来10。-D-半乳糖苷酶在种子发芽的前期主要负责水解含有-D-半乳糖基侧链的寡糖，在种子发芽的后期主要负责水解半乳甘露聚糖11。文献报道多集中在种子发芽过程中-D-甘露聚糖酶的性质研究，而对此过程中-D-半乳糖苷酶的变化研究较少12。因此，本研究对皂荚种子发芽过程进行模拟，对不同发芽时间的皂荚种子内-D-半乳糖苷酶的酶活和半乳甘露聚糖理化性质进行了比较研究，以期为酶法改性皂荚半乳甘露聚糖产品的开发提供理论依据。1实 验1 1材料与仪器皂荚种子于 2020 年 10 月采摘于北京林业大学家属院小区内。经体积分数 75%的酒精擦拭杀菌后置于霉菌培养箱中，备用。D-半乳糖和 D-甘露糖均为单糖标准品，美国 Sigma 公司;对硝基酚-D-吡喃半乳糖(p-NPG)，上海迈瑞尔化学技术有限公司。其他的化学品和试剂均为分析纯。立式压力蒸汽灭菌器，上海东亚容器制造有限公司;洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司;净化工作台和霉菌培养箱，上海跃进医疗器械有限公司;水浴恒温磁力搅拌器，金坛市美特仪器制造有限公司;L-550 台式低速大容量离心机，长沙市湘仪仪器有限公司;FA1004 分析天平，上海精密科学仪器有限公司;LVDV-+流变仪，美国 Brookfield 公司;Waters e2695 型高效液相色谱仪，美国 Waters 公司;UV-6100A 紫外可见分光光度计，上海比朗仪器有限公司;均质机，瑞士 Kinematica AG 公司。1 2皂荚种子发芽试验在培养皿中先铺一层脱脂棉，然后盖一层纱布。取 540 粒皂荚种子，每个培养皿放入 30 粒种子。在种子表面盖上一层纱布后，向每个培养皿中加入20 mL 蒸馏水。随后，将培养皿分为两组，分别置于 25和35 霉菌培养箱(相对湿度60%)中进行种子发芽实验。发芽过程中所用的仪器和去离子水都经过高压灭菌锅灭菌(121 灭菌20 min)，将不同发芽时间的种子经手工剥离得到种皮、内胚乳和胚芽子叶。1 3皂荚半乳甘露聚糖的提取称取 1 g 内胚乳(绝干质量)置于锥形瓶中，加入 199 g 去离子水，使用均质机均质 30 min(转速10 000 r/min)，然后置于 85 水浴下磁力搅拌30 min，冷却至室温后离心(4 000 r/min，20 min)取上清液。向上清液中加入等体积的无水乙醇进行醇沉并离心(4 000 r/min，20 min)，取沉淀。用无水乙醇洗涤沉淀 2 3 次，在 55 下真空干燥 5 h，并研磨得到皂荚半乳甘露聚糖。1 4-D-半乳糖苷酶酶活的测定14 1对硝基酚标准曲线的绘制用 0 2 mol/L 碳酸钠溶液配置 10 mmol/L 的对硝基酚母液，分别稀第 1 期裴滢莹，等:皂荚种子发芽期间酶活及多糖结构与流变性质的比较研究135释为 0 05、0 10、0 15、0 20、025、030、035、0 40 和 0 45 mmol/L 的对硝基酚标准溶液，以吸光度(Y)为纵坐标，对硝基酚浓度(X)为横坐标绘制成标准曲线:Y=0 457 66X+0 002 09(2=0 999 2)。1 4 2-D-半乳糖苷酶酶活的测定将对硝基酚-D-吡喃半乳糖(p-NPG)作为-D-半乳糖苷酶酶活的测定底物。称取0 5 g 不同发芽时间的内胚乳，加入50 mL 0 05 mol/L 醋酸钠缓冲液(pH 值5 0)，经均质机处理，得到均质液，离心后取上清液。上清液和 p-NPG 溶液于37 下振荡预热10 min，然后吸取2 mL 上清液和1 mL 10 mmol/L p-NPG 溶液充分混合，于37 恒温振荡10 min，加入5 mL 0 2 mol/L 碳酸钠溶液终止酶解反应。用紫外可见分光光度计在波长 400 nm 处测定酶液的吸光度值。酶活单位定义:在 37 和 pH 值 5 0 条件下，每分钟内底物降解释放 1 mol 对硝基酚所需的酶量定义为 1 个硝基酚酶国际单位 U。样品中的对硝基酚酶活(E，U/g)根据式(1)计算13 14。E=Ax A()0 K+C0 Dfm Dr t (2/50)(1)式中:Dr绝干率，%;Ax样品酶液的吸光度值;A0对应酶液的空白吸光度值;K对硝基酚标准曲线的斜率;C0对硝基酚标准曲线的截距;Df稀释倍数;m内胚乳/胚芽子叶的质量，g;t反应时间，min;2/50均质后得到的 50 mL 溶液中取 2 mL 来进行测试。1 5皂荚半乳甘露聚糖的单糖组成、流变特性和分子质量的测定1 5 1单糖组分分析采用 NEL/TP-510-42618 方法测定皂荚半乳甘露聚糖中的单糖组成15。具体步骤如下:分别称取约 0 15 g(以绝干质量计，下同)不同发芽时间的皂荚半乳甘露聚糖于耐压瓶中，加入 1 5 mL 质量分数 72%H2SO4，在 30 下水解 1 h，随后加入 42 mL 的去离子水(将硫酸质量分数调至 4%)，于 121 下继续水解 1 h。水解完毕后，水解液经碳酸钙中和(pH 值 5 7)和阳离子吸附树脂吸附 Ca2+后，水解液经 0 22 m 滤膜过滤。采用配备 HPX-87P 糖分析柱(300 mm 7 8 mm，9 m)和蒸发光散射检测器(ELSD)的高效液相色谱(HPLC)测定皂荚半乳甘露聚糖的单糖含量。流动相和流速分别为超纯水和 0 6 mL/min，柱温和检测器温度分别为 75 和 35，使用 D-半乳糖和 D-甘露糖标准品建立峰面积与单糖浓度的标准曲线，从而依据 HPLC 分析的样品中的单糖峰面积计算出皂荚半乳甘露聚糖的单糖浓度，并根据式(2)计算得到半乳甘露聚糖的质量分数(P)。P=c 0 9 0 043 5m 100%(2)式中:c液相色谱中单糖(D-半乳糖和 D-甘露糖)的质量浓度，g/L;0 9单糖与聚糖的换算系数;0 043 5水解体系的总体积，L;m不同发芽时间皂荚半乳甘露聚糖的绝干质量，0 15 g。1 5 2流变性能测定称取 1 g 不同发芽时间的皂荚内胚乳置于锥形瓶中，加入 199 g 的去离子水，均质 30 min(转速为 10 000 r/min)，并在 85 磁力搅拌 30 min(保证皂荚半乳甘露聚糖的完全水合)，制成质量分数为 0 5%的半乳甘露聚糖胶液16。冷却后，用流变仪在室温下进行测试，测定不同发芽时间下皂荚半乳甘露聚糖的表观黏度，以及剪切应力随剪切率(0 85 s1)的变化并绘制关系曲线。1 5 3分子质量的测定将不同发芽时间的皂荚半乳甘露聚糖用 0 1 mol/L NaNO3配成 0 4 g/L 的胶液并过 0 45 m 的滤膜。采用配备 TSKgel guardcolumn PWXl柱(40 mm 6 0 mm，12 m)、TSKgelG5000 PWXl柱(500 mm 7 5 mm，7 m)、TSKgelG 3000 PWXl柱(300 mm 7 5 mm，7 m)和示差折光检测器(ID)的高效液相色谱(HPLC)，测定皂荚半乳甘露聚糖的重均相对分子质量(Mw)。流动相和流速分别为 0 1 mol/L 硝酸钠溶液和 1 mL/min，检测器温度和柱温分别为 35 和 40。2结果与讨论2 1皂荚发芽过程对-D-半乳糖苷酶酶活的影响皂荚种子的内胚乳和胚芽子叶中-D-半乳糖苷酶随发芽时间和温度的变化见图 1。由图 1(a)可知，25 时，内胚乳内-D-半乳糖苷酶的酶活先在 3 45 5 78 U/g 上下浮动(前 8 天)，然后迅速增加至 86 12 U/g(第 14 天)，约为发芽第 8 天酶活的 14 89 倍。35 时，在发芽的第 2 14 天，内胚乳内136林产化学与工业第 43 卷-D-半乳糖苷酶的酶活在331 924 U/g 上下浮动。可以看出，在皂荚种子发芽的第 8 14 天，与 35 相比，25 更有利于皂荚内胚乳内-D-半乳糖苷酶酶活的增加。由图 1(b)可知，25 时胚芽子叶内-D-半乳糖苷酶的酶活在 23 60 39 95 U/g 上下波动(第 2 14 天);35 时胚芽子叶内-D-半乳糖苷酶的酶活先在21 29 31 54 U/g 上下波动(第2 10 天)，然后迅速增加至67 46 U/g(第14 天)。在发芽第2 10 天，25 时胚芽子叶内-D-半乳糖苷酶的酶活总体高于35 时的酶活(第4 天除外)，而在发芽第12 14 天，35 时胚芽子叶内-D-半乳糖苷酶的酶活高于25 时的酶活。eid 等9 研究发现在葫芦巴种子的发芽过程中，内胚乳内-D-半乳糖苷酶的酶活急剧增加，而胚芽子叶内-D-半乳糖苷酶的酶活增长缓慢，这与25 时内胚乳和胚芽子叶内-D-半乳糖苷酶的酶活变化有相似之处。此外，在发芽第 2 14 天，胚芽子叶内-D-半乳糖苷酶的酶活始终高于内胚乳内-D-半乳糖苷酶的酶活(25 下发芽第 14 天除外)。Shivanna 等17 研究发现，25 时，在发芽的第 1 7 天，瓜尔豆种子中的-D-半乳糖苷酶的酶活呈现先增加再降低的趋势。因此，不同植物种子内-D-半乳糖苷酶的酶活在发芽过程中变化规律是不同的。a 内胚乳 endosperm;b 胚芽子叶 cotyledon图 1发芽时间和温度对-D-半乳糖苷酶酶活的影响Fig 1Effect of germination time and temperature on-D-galactosidase activity2 2皂荚半乳甘露聚糖的糖含量25 和 35 下不同发芽时间的皂荚半乳甘露聚糖的糖含量变化见表 1。表 1发芽过程中半乳甘露聚糖的变化Table 1Changes of galactomannan during germination发芽温度/germination temperature发芽天数/dgermination days半乳糖/%galactose甘露糖/%mannose半乳甘露聚糖/%galactomannanM/G 值1)M/G value0235868 3291902903221067 6889773065209267 728864324256209866 3887363168207065 79864931810205664 16847231212201263 71838331614197763 2483003200235868 3291902903190662 0181073255190060 057905316356182459 5577793268181659 29774532610181559 20773632612182859 23775132414177758 7876543311)M/G 值:甘露糖与半乳糖的质量比值 M/G value:the mass ratio of mannose to galactose第 1 期裴滢莹，等:皂荚种子发芽期间酶活及多糖结构与流变性质的比较研究137由表 1 可知，未发芽前，皂荚半乳甘露聚糖主要由 23 58%的半乳糖和 68 32%甘露糖组成。随着发芽时间的延长，25 下发芽 14 天时，甘露糖质量分数降低至 63 24%，半乳糖质量分数降低至19 77%，半乳甘露聚糖质量分数降低至 83 00%。35 下发芽 14 天时甘露糖质量分数降低至58 78%，半乳糖质量分数降低至17 77%，半乳甘露聚糖质量分数降低至76 54%。与25 相比，35 下皂荚半乳甘露聚糖含量的降低幅度更为明显，这可能是因为 35 更有利于皂荚半乳甘露聚糖的降解9。Bakhshy 等18 发现在葫芦巴种子的发芽过程中，半乳甘露聚糖被水解，其含量呈现下降的趋势。Mccleary 等19 也发现在苜蓿和角豆种子发芽过程中，种子内半乳甘露聚糖含量在-甘露聚糖酶的作用下会逐渐降低。随着发芽时间的延长，25 下甘露糖与半乳糖质量比值(M/G 值)从 2 90 增加至 3 20，此时，内胚乳内-D-半乳糖苷酶酶活增加至 86 12 U/g(发芽第 14 天);35 下 M/G 值从 2 90 增加至 3 31，此时，内胚乳内-D-半乳糖苷酶酶活增加至 9 24 U/g(发芽第 14 天)。这可能是因为皂荚半乳甘露聚糖在-D-半乳糖苷酶作用下脱去部分半乳糖，从而使半乳糖的含量下降，进而使 M/G 值增加。与25 相比，35 更有利于获得高 M/G 值的皂荚半乳甘露聚糖。发芽皂荚半乳甘露聚糖经过酶法改性，有望成为价格昂贵的刺槐豆胶半乳甘露聚糖(M/G 值为 4 00)的替代产品20。2 3皂荚半乳甘露聚糖的分子质量皂荚种子发芽过程中半乳甘露聚糖分子质量的变化见表 2。由表 2 可知，无论发芽温度是 25 还是 35，随着发芽时间的延长，皂荚半乳甘露聚糖分子质量都呈现出逐渐降低的趋势。在 25 下，皂荚半乳甘露聚糖分子质量从402 106g/mol 降低至305 106g/mol(发芽第 10 天)，最终降低至 035 106g/mol(发芽第 14 天)。在 35 下，皂荚半乳甘露聚糖分子质量从 4 02 106g/mol 降低到 1 79 106g/mol(发芽第10 天)，最终降低至1 58 106g/mol(发芽第14 天)。在发芽前10 天，35 时皂荚半乳甘露聚糖分子质量下降幅度相比 25 更大;而在发芽第 12 14 天，25 时皂荚半乳甘露聚糖分子质量下降幅度相比 35 更大。该现象可能是由皂荚半乳甘露聚糖含量逐渐降低(表 1)和-D-半乳糖苷酶酶活增加(图 1)引起的，根本原因可能是内切-D-甘露聚糖酶、-D-甘露糖苷酶和-D-半乳糖苷酶协同作用的结果9 10。eid 等9 发现在葫芦巴种子的发芽过程中，随着-D-半乳糖苷酶酶活急剧增加，半乳甘露聚糖分子质量呈现出逐渐降低的趋势，这与本研究结果相似。表 2发芽过程中半乳甘露聚糖分子质量的变化Table 2Changes in molecular weight of galactomannan during germination发芽温度/germination temp不同发芽天数下的分子质量(Mw)molecular mass at different germination days/(106，g mol1)0 d6 d8 d10 d12 d14 d254 023 73354305048035354 023 202751791831582 4皂荚半乳甘露聚糖的流变学分析流变学性质间接反映了多糖的分子结构变化，主要受皂荚半乳甘露聚糖的分子质量和 M/G 值的影响21。其中，分子质量对黏度的影响较大22 23。不同剪切率下，皂荚半乳甘露聚糖的流变实验结果如图 2 所示。从图 2(a1)和 2(b1)可以看出，25 下，在发芽第 3 6 天，随着剪切率的增加，皂荚半乳甘露聚糖溶液的剪切应力逐渐增加，表观黏度逐渐降低，溶液表现出剪切稀化行为，为假塑性流体24 25，这可能是由皂荚发芽过程中半乳甘露聚糖分子质量和含量降低造成的，皂荚半乳甘露聚糖的分子质量从 3 91 106g/mol 降低至 3 73 106g/mol，半乳甘露聚糖质量分数从 89 77%降低至 87 36%。而该现象的根本原因可能是内切-D-甘露聚糖酶、-D-甘露糖苷酶和-D-半乳糖苷酶的协同作用。由于内切-D-甘露聚糖酶、-D-甘露糖苷酶负责断裂半乳甘露聚糖的主链，对半乳甘露聚糖溶液的黏度和剪切应力影响较大，而-D-半乳糖苷酶负责断裂半乳甘露聚糖的侧链，因而对半乳甘露聚糖溶液的黏度和剪切应力影响相对较小9 10。在发芽第 6 12 天，溶液的表观黏度进一步降低，第 12 天从假塑性流体(非牛顿流体)向牛顿流体(随着剪切率的增加，剪切应力和表观黏度不变)转变。相似的，从图 2(a2)138林产化学与工业第 43 卷和 2(b2)可以看出，35 下，随着发芽时间的延长，随着剪切率的增加，皂荚半乳甘露聚糖溶液的表观黏度逐渐降低，剪切应力逐渐增加。125;235 a 表观黏度 apparent viscosity;b 剪切应力 shear stress图 2皂荚种子发芽过程中半乳甘露聚糖的流变学曲线Fig 2heological curves of galactomannan during seed germination of G sinensis3结 论3 1本实验通过模拟皂荚种子发芽的过程，比较研究了内胚乳和胚芽子叶内-D-半乳糖苷酶酶活的变化。研究发现:随发芽时间的延长，胚芽子叶内-D-半乳糖苷酶的酶活大多高于内胚乳内-D-半乳糖苷酶的酶活。3 2对不同发芽阶段的皂荚半乳甘露聚糖进行高效液相色谱分析，结果表明:随着发芽时间的延长，甘露糖和半乳糖的含量逐渐降低，甘露糖与半乳糖质量比值(M/G 值)逐渐升高，较高发芽温度(35)更有利于获得高 M/G 值的皂荚半乳甘露聚糖;皂荚半乳甘露聚糖分子质量逐渐降低，在发芽前期，35 发芽温度时皂荚半乳甘露聚糖的分子质量下降幅度更大。3 3流变性能测试表明:随着发芽时间的延长，皂荚半乳甘露聚糖溶液的表观黏度随着剪切率的增加而逐渐降低并趋于稳定，25 下溶液会从假塑性流体向牛顿流体发生转变。参考文献:1琚斯怡，郭常酉，朱妙馨，等 皂荚和美国肥皂荚多糖胶的制备及性质比较J 生物质化学工程，2019，53(5):2126JU S Y，GUO C Y，ZHU M X，et al Comparison of preparation and properties of 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