Schizochytriumsp_发酵生产DHA培养基的优化.pdf

收稿日期:2007-01-22;修回日期:2007-04-09作者简介:周 林(1980-),男,在读硕士;主要从事生物化工方面的研究工作。文章编号:1003-7969(2007)06-0032-03 中图分类号:TS202 文献标识码:ASchizochytriumsp.发酵生产DHA培养基的优化周 林1,卢英华1,2,何 宁1(1.厦门大学化学工程与生物工程系,361005福建省厦门市;2.厦门大学福建省化学生物学重点实验室,361005福建省厦门市)摘要:以筛选得到的Schizochytriumsp.菌株作为研究对象,考察了培养基碳源、氮源对该菌株生物量的影响,通过响应面法建立了菌体生物量与葡萄糖、酵母粉以及玉米浆浓度之间的关系,得到较佳培养基组成为:126 g/L葡萄糖、10 g/L酵母膏、2 g/L玉米浆、5 g/L蛋白胨、0.5倍浓度自然海水1 L。摇瓶发酵结果表明:在5 d培养时间,Schizochytriumsp.生物量、积累油脂以及DHA分别可达42.9、34.1、13.8 g/L。关键词:Schizochytriumsp.;DHA;培养基;响应面法;生物量M edium opti m ization forSchizochytriumsp.to producedocosahexaenoic acid(DHA)ZHOU Lin1,LU Ying2hua1,2,HE Ning1(1.Depart ment of Chemical and Biochemical Engineering,Xiamen University,361005 Fujian Xiamen,China;2.KeyLaboratory for ChemicalBiology of Fujian Province,Xiamen University,361005 Fujian Xiamen,China)Abstract:One strain ofSchizochytriumsp.was selected as the mode microorganis m to evaluate theinfluences of carbon and nitrogen resource on the biomass.By employing response surface method,therelationship between biomass and nutrientswas founded and the opti mized culture medium forSchizochy2triumsp.was deter mined.The optimized medium consisted of 126 g/L glucose,10 g/L yeast extract,2g/L corn steep liquor,5 g/L soy peptone and half the salt concentration of seawater 1 L.The maximumbiomass,total fatty acid and DHA reached 42.9 g/L,34.1 g/L and 13.8 g/L on the optimized culturemedium after 5 days incubation,respectively.Key words:Schizochytriumsp.;DHA;medium;response surface method(RS M);biomass 二十二碳六烯酸(DHA)是一种极其重要的n-3系列高度不饱和脂肪酸,具有多种重要生理功能1,2,已被开发成各种药物、功能食品和化妆品等35,呈现巨大的市场。目前,深海鱼油是DHA的主要来源。由于鱼油DHA含量相对比较低、油的品质不稳定、易受捕捞时间和地域等诸多因素的影响,不能满足日益增长的市场需求,探求新的DHA资源就显得十分迫切。微生物因其生长易于调控、易于大规模培养等优点,有望成为高纯度DHA的又一有效来源。不足之处是生物量相对比较低。本研究从筛选得到的Schizochytriumsp.入手,通过考察培养基中主要成分对其生物量的影响,设计适合Schizochytriumsp.发酵的培养基,以期为微生物来源DHA的工业化生产打下一定的基础。1 材料与方法1.1 菌种和培养基Schizochytriumsp.系本课题组筛选所得。种子培养基:30 g/L葡萄糖,10 g/L酵母膏,0.5倍浓度自然海水。发酵培养基:葡萄糖、酵母膏、大豆蛋白胨以及玉米浆,其用量由实验确定,其他成分组成为0.5倍浓度自然海水。1.2 实验方法1.2.1 细胞培养 种子培养:将保藏于-71 的菌种转接于平板加适量海水封盖,25 培养45 d。然后取35 mL经活化的菌种,接入装有100 mL种子培养基的500 mL三角瓶,25、200 r/min培养2 d。摇瓶发酵:取5 mL种子液接入装有50 mL发酵23中 国 油 脂 2007年第32卷第6期 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/培养基的250 mL三角瓶,25、200 r/min培养3 d。1.2.2 生物量的测定 取一定量的发酵液,8 000r/min、4 冷冻离心10 min后移至已知恒重的平板,于-0.09-0.1 MPa、5565真空干燥24h,称重计数。1.2.3DHA的测定1121311油 脂 的 提 取 取 一 定 量 的 发 酵 液8 000 r/min、4冷冻离心10 min得湿菌体,加入CH3Cl3-CH3OH(21)10 mL抽提油脂。重复23次直到抽提液无色,然后于-0.09-0.1MPa 4550 真空干燥56 h,称重。1121312 甲酯化处理 取一定量的油脂和花生酸,置于50 mL的磨口三角瓶中,分别加入10 mL 0.8mol/L的KOH-CH3OH溶液和(C2H5)2O-BF3溶液,于65 水浴回流10 min进行皂化,冷却后加入15 mL正己烷振荡,然后加入足量的饱和食盐水,静置分层后取上层正己烷相,抽取上层,并加入无水硫酸钠脱水。1121313气相色谱分析6 选用Agilgent DB-WAX色谱柱(30 m0125 mm)。采用程序升温:初始温度180,保持2 min,然后按6/min升到240,保持15 min。柱压100 kPa,进样口温度220,检测器温度240。用内标法定量,内标为花生酸。2 结果与讨论2.1 培养基中不同成分对Schizochytriumsp.生物量的影响以基础发酵培养基为初始培养基,以葡萄糖(x1)、酵母粉(x2)、玉米浆(x3)、蛋白胨(x4)为实验因子,生物量(y)为响应值,进行部分因子实验,对实验结果进行一元线性回归可得如下方程:y=131286+21688x1+01309x2-01364x3+01136x4(1)由该方程的方差分析得,F=78.389 F4,15,0.01=4.89,说明该模型的概率在=0.01的水平上差异显著,复相关系数R2=0.954,表明近95.4%的实验数据可以用该模型解释。4个实验因子对菌体生长的影响依次是x1x3x2x4,其中x4(Sig.=01392)较其他因子对菌体生物量的影响较小,将其含量固定在5 g/L进行最陡爬坡实验。2.2 最陡爬坡路径的选择在2.1回归得到的模型基础上,进行爬坡实验。葡萄糖(x1)和酵母膏(x2)系数为正,所以增加两者的浓度,而玉米浆(x3)系数为负,减少玉米浆的用量。实验设计及结果见表1。表1 爬坡路径及结果实验号葡萄糖x1(g/L)酵母粉x2(g/L)玉米浆x3(g/L)生物量y(g/L)1305514.1822606423.9263907332.12941208233.93651509128.361618010016.522 由表1可知,随着培养基中各成分含量的改变,菌体生物量也随之改变。实验4对应的菌体生物量达到最大,随后菌体量又有所降低,说明该范围已接近最优的浓度范围,确定以实验4中各成分的浓度进行下面的优化实验。2.3 培养基的优化用中心组合设计对培养基中关键组分葡萄糖(x1)、酵母膏(x2)以及玉米浆(x3)浓度进行优化,实验设计及结果见表2。表2 中心组合设计实验结果以及实验观测值 与模型预测值的比较葡萄糖x1酵母粉x2玉米浆x3生物量y实验值预测值-1-1-131.33929.9951-1-132.86432.566-11-133.33732.94911-134.38634.455-1-1129.83829.3931-1131.36831.379-11133.70334.13511134.59835.565-1.6820027.66828.5241.6820031.78731.4610-1.682029.30030.65301.682037.48036.65800-1.68232.93934.226001.68235.40934.65300036.52636.08600036.14036.08600035.76036.08600035.92836.08600036.36836.08600035.88636.086 利用SPSS 12.0统计软件对表2中实验数据进行拟合,得到以菌体生物量为响应值的多元回归拟合二次模型:y=361086+01873x1+11785x2+01127x3-21154x21-01859x22-01582x23-01139x1x2-010186x1x3+01447x2x3(2)模型二次项系数为负值,开口向下。复相关系数达到0.929,表明模型数据与实验拟合程度较好。332007年第32卷第6期 中 国 油 脂 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/变量分析和方差分析结果见表3、表4。表3 实验变量分析项 目系数标准方差tSig.常数36.0860.40788.6860.000 x10.8730.2703.2350.009x21.7850.2706.6610.000 x30.1270.2700.4710.648x21-2.1540.263-8.1970.000 x22-0.8590.263-3.2700.008x23-0.5820.263-2.2150.051x1x2-0.1390.353-0.3940.702x1x3-0.01860.353-0.0530.959x2x30.4470.3531.2670.234表4 实验方差分析来 源平方和D.F.均方FSig.Regression130.224914.469 14.5370.000Residual9.953100.995Total140.17819 注:R2=0.929,F=14.537 F3,16,0.01=5.29。为更直观地描述培养基中各组分对Schizochy2triumsp.生物量的影响,做出模型(2)的二维等高图(见图1),另一维变量的编码值取0水平。由等高图可以确定最佳发酵培养基为:126.20 g/L葡萄糖,10.08 g/L酵母膏,2.06 g/L玉米浆,考虑到实际配制的方便,得到较佳培养基组成为:126 g/L葡萄糖、10 g/L酵母膏、2 g/L玉米浆、5 g/L蛋白胨、0.5倍浓度自然海水1 L。图1 中心组合设计实验等高图2.4 摇瓶发酵过程以2.3中优化的培养基,以50 mL/250 mL的装液量,5%的接种量,25 摇瓶培养,每隔24 h取样,摇瓶发酵培养5 d,Schizochytriumsp.生物量、积累油脂以及DHA分别可达42.9、34.1、13.8 g/L。如图2所示。图2 摇瓶发酵过程菌体、油脂以及DHA变化曲线3 结 论(1)碳源、氮源浓度对Schizochytriumsp.生长有较大的影响,相对较高的CN有助于Schizochytriumsp.中不饱和脂肪酸的积累。(2)借助于响应面法,得到较佳培养基组成为:126 g/L葡萄糖、10 g/L酵母膏、2 g/L玉米浆、5 g/L蛋白胨、0.5倍浓度自然海水1 L。(3)在已优化的培养基上,摇瓶发酵培养5 d,Schizochytriumsp.生物量、积累油脂以及DHA分别可达42.9、34.1、13.8 g/L,较未优化前提高了近5倍。参考文献:1Alonso D L,Maroto F G.Plant as“chemical factory”forthe production polyunsaturated fatty acidJ.Biotechnol.Adv.,2000,18:481-49712Rose D P,Connolly J M.Omega-3 fatty acid as cancerchemopreventiveagents J.Phar macol.Therapeut,1999,83:217-24413Linko Y Y,Hayakawa K.Docosahexaenoic acid:a valu2able nutraceutical trends J.Food Sci.Technol.,1996,(7):59-6314Nettleton J A.Aren-3 fatty acids essential nutrients forfetal and infant development J.J.Am.Diet Assoc.,1993,93:58-6415Pigolt GM,Tucker B W.Science opens new horizon formarine lipids in human nutrition J.Food Rev.Int.,1987,3:105-13816Singh A,Ward O P.Production of high yields of docosa2hexaenoic acid by 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