血清甘胆酸、甲胎蛋白联合乙...测在肝细胞肝癌中的临床价值_赖蜜.pdf

第 42 卷 第 12 期2022 年 12 月Vol.42 NO.12DEC.2022赣南医学院学报JOURNAL OF GANNAN MEDICAL UNIVERSITY投稿网址：http：/血清甘胆酸、甲胎蛋白联合乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变检测在肝细胞肝癌中的临床价值赖蜜，胡蝶，王晓玲，钟田雨（赣南医学院第一附属医院检验科，江西 赣州 341000）摘 要：目的：探讨血清甘胆酸、甲胎蛋白（-fetoprotein，AFP）和乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变的关系及对肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）诊断的意义。方法：收集2020年12月2022年2月在我院诊疗的HCC患者200例，分为乙肝肝癌组（100例）和非乙肝肝癌组（100例）。采用免疫比浊法检测血清甘胆酸、双抗体夹心法检测血清AFP、PCR-反向点杂交法检测HBV前C区/BCP区突变，通过SPSS 22.0软件进行联合分析。结果：乙肝肝癌组的血清AFP水平显著高于非乙肝肝癌组的血清AFP（P0.05）；在乙肝肝癌组中，HBV基因突变组血清AFP高于HBV基因未突变组（P0.05），其中BCP区突变组AFP水平高于BCP区未突变组（P0.05）。结论：血清AFP水平与HCC类型和HBV突变类型有潜在相关性，对HCC的发病机制了解和诊断有重大参考价值。关键词：肝细胞肝癌；甘胆酸；甲胎蛋白；乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变中图分类号：R735.7，R446.62 文献标志码：A 文章编号：1001-5779（2022）12-1227-05 DOI:10.3969/j.issn.1001-5779.2022.12.001开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Clinical value of serum cholyglycine，AFP combined with mutation detection of hepatitis B virus pre-C region/BCP region in HCCLAI Mi，HU Die，WANG Xiao-ling，ZHONG Tian-yu（Laboratory Department，The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou，Jiangxi 341000）Abstract :Objective :To explore the relationship between cholyglycine，AFP and mutations in the pre-C region/BCP region of hepatitis B virus，and its significance in the diagnosis of hepatocellular carcinoma（HCC）.Methods :From December 2020 to February 2022，a total of 200 cases with HCC in our hospital were divided into hepatitis B group（100 cases）and non-hepatitis B group（100 cases）.Immunoturbidimetric method was used to detect cholyglycine，double anti-body sandwich method to detect AFP，PCR-reverse dot blot to detect the mutation of HBV pre-C region/BCP region，and SPSS 22.0 software was used for conjoint analysis.Results :The AFP level in the hepatitis B group was significantly higher than that in the non-hepatitis B group（P0.05）.Among the hepatitis B group，the AFP of the HBV mutation group was higher than that of the non-mutated group（P0.05），and the level of AFP in the mutant group was higher than that in the non-mutated group in the former C region（P0.05）.Conclusion :AFP has potential correlations with HCC types and HBV mutation types，and has great reference value for understanding and diagnosing the disease.Key words :Hepatocellular carcinoma；Cholyglycine；-fetoprotein；HBV C region/BCP region mutation肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是我国常见恶性肿瘤之一，也是第三大癌症死亡原因1。HCC的高致死率与 HCC的高恶性程度和发病隐匿有关，大部分患者确诊时已为晚期，错过了基金项目：国家自然科学基金项目（82260422）；江西省卫生健康委员会科技计划项目（202130700）；赣州市指导性科技计划项目（GZ2019ZSF036）；赣南医学院第一附属医院院级科技计划项目（YJYB202075）作者简介：赖蜜，女，本科，讲师，主管技师，研究方向：生物化学。E-mail：通信作者：钟田雨，男，博士，教授，主任医师，硕士生导师，研究方向：疾病诊断和预后的分子标志物。E-mail： 12272022 年赣 南 医 学 院 学 报投稿网址：http：/最佳治疗时机。目前，HCC的诊断依赖于血清学检查、影像学检查和病理学检查，但都无法对早期HCC进行诊断。甲胎蛋白（-fetoprotein，AFP）是一种针对肝癌的肿瘤标记物，临床上被广泛用于肝癌的辅助诊断和术后复发的监测2。但是AFP的检测也被证明缺乏灵敏性和特异性，多达40%的HCC患者血清AFP处于正常水平，尤其多见于早期HCC患者3。然而在一些慢性乙型肝炎和肝硬化患者上又见显著升高4-5。肝脏作为人体重要的代谢器官，组织代谢组学方法是研究肝癌代谢异常的重要手段。甘胆酸是胆酸与甘氨酸结合形成的一种结合型胆酸，甘胆酸作为肝脏代谢产物，其水平可以动态反映肝脏损伤过程。相比较谷丙转氨酶、谷草转氨酶等常规肝功能检测指标，甘胆酸更敏感且能对早期肝炎、肝硬化进行疗效评估和早期诊断6。一项百人的队列研究表明，HCC患者血清甘胆酸水平显著高于健康人群7。因此，甘胆酸在监测和诊断HCC方面具有潜在价值。据估计，全球约有47%肝细胞癌病例发生在中国，其中70%的HCC患者为乙肝相关性HCC8-9。乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）DNA的变异被认为是HCC的危险因素。由于HBV逆转录酶缺乏校对功能，HBV DNA容易出现突变，且突变率是其他 DNA 病毒的 10 倍10-11。其中与 HCC 相关的BCP 区（Basal core promoter，BCP）和前 C 区（Pre-core，C）的突变最为常见。HBV BCP区主要突变包括A1762T/G1764A。研究表明，这种双突变可提高HBV的复制率12。多项队列研究表明，BCP双突变与HCC进展具有紧密相关性13-14。伴随BCP区双突变的乙肝携带者在术后也更容易发生转移15。HBV前C区常见G1896A突变，其突变也与HBV的复制程度相关16。前 C区突变多见于慢性乙肝患者，其突变造成终止密码子形成，影响HBeAg的表达并引起HBV免疫逃逸17。这对疾病判断和疾病干预带来严峻挑战。因此，准确判断HBV是否突变及突变类型对肝癌诊断、治疗和预后具有重要意义。目前，已有大量关于单独甘胆酸、AFP和乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变在HCC诊断中的意义的研究。但很少有关于三者潜在联系在HCC诊断的报道。本研究收集了200例肝癌患者，包括100例乙肝肝癌患者和100例非乙肝肝癌患者。通过对血清甘胆酸、AFP和乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变的联合检测，探讨甘胆酸、AFP和乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变在HCC之间的关联，以及三者联合检测在HCC临床诊断中的价值。1 材料和方法 1.1研究对象 选取2020年12月2022年2月在本院就诊的HCC患者血清200例，其中100例肝细胞癌患者经化学发光法检测HBV病毒表面抗原阳性（HBsAg0.05 IU mL-1），100 例 肝 细 胞 癌 患 者HBV 病毒表面抗原阴性（HBsAg0.05 IU mL-1）。将200例患者分为乙肝肝癌组和非乙肝肝癌组。1.2纳入和排除标准 纳入标准：HCC患者均经影像学和病理学诊断明确，符合 原发性肝癌的临床诊断与分期标准18。患者及其家属对此次研究内容知情并签署知情同意书。排除标准：（1）患者合并其他恶性肿瘤；（2）患者有严重凝血功能障碍。1.3仪器与试剂 1.3.1仪器迈瑞 BS-820M 生化仪、罗氏 Elecsys e602全自动电化学发光仪，ABI2720PCR扩增仪。1.3.2试剂甘胆酸试剂盒购于美康生物科技有限公司，AFP试剂盒购于罗氏制药有限公司，乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变检测试剂购于达安基因有限公司。1.4检测方法 1.4.1血清甘胆酸的检测取入组患者外周血35 mL，收集于含分离胶的真空采血管中。接收样本后，放入离心机1 600 g离心10 min及时分离血清用于后续项目检测或70 保存待检。使用迈瑞BS-820M生化仪，在质控标准下按照说明书进行操作。检测方法为胶乳增强免疫比浊法，检测线性范围为0.580 mg L-1。1.4.2血清AFP的检测收集入组患者血清，使用罗氏Elecsys e602全自动电化学发光仪，在质控标准下按照说明书进行操作。检测方法为电化学发光法，检测范围0.51 000 ng mL-1。1.4.3乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变检测按照 说 明 书 操 作 取 入 组 患 者 血 浆，加 入 引 物 在ABI2720 中进行 PCR 扩增，按比例（HBV preC/BCP突变PCR反应液42 L/人份+HBV preC/BCP突变酶系3 L/人份）取相应量的PCR反应液及酶系，充分混匀后按45 L/管分装至0.2 mL离心管中，然后分别取处理后样品、阳阴性质控品5 L，加入到0.2 mL 122812 期赖蜜，等 血清甘胆酸、甲胎蛋白联合乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变检测在肝细胞肝癌中的临床价值投稿网址：http：/离心管中，6 000 rpm 瞬时（3 s）离心，将各反应管放入PCR仪。50 3 min；93 5 min；（93 30 s54 45 s72 30 s）45 个循环，最后 72 保温7 min后再进行杂交显色。杂交显色具体步骤如下：杂交液与杂交液预热至42，备用；杂交液（完全浸没膜条），备用；将PCR产物加入对应的杂交显色液离心管中，使得膜条在杂交过程中低速转动（100150 转 min-1），杂交45 min；放入水浴水槽（42），100 转 min-1，水浴 5 min，弃杂交液。加入20 mL结合液，放置于2030 脱色摇床上摇摆（3050 转 min-1），避光反应10 min。弃结合液，弃杂交液。再将50 mL离心管倒置于吸水纸上，吸干管底液体。加入相应量的显色液，避光反应510 min；当显色弱时，可适当延长显色时间。显色反应结束后，立即弃显色液，加入20 mL溶液，脱色摇床上摇摆 2 min。弃溶液，加入 20 mL 去离子水，轻摇23 min取出。用吸水纸吸去膜条表面水分，尽快在扫描仪上扫描膜条 若不能立即进行扫描，请冻存于（-205）。参照达安膜条斑点识别分析系统操作说明书的要求，使用扫描仪扫描膜条，设定相应的参数并输出扫描结果，然后进行数据分析 HBV 前 C 区 ntA1896（nt1896G-A）、ntA1899（nt1899G-A）突变，BCP 区 nt1762/A1764（nt1762A-T、nt1764G-A）联合突变情况。1.5统计学方法 数据采用 SPSS 22.0统计软件进行处理。计数资料以n（%）表示，计量资料以-xs表示，组间比较采用独立样本t检验；P0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1一般资料 乙肝肝癌组共100例患者，化学发光法检测血清HBsAg均为阳性（HBsAg0.05 IU mL-1），其 中 男 性 90 例，女 性 10 例，平 均 年 龄（55.0010.72）岁。非乙肝肝癌组100例患者，化学发光法检测血清HBsAg均为阴性（HBsAg0.05 IU mL-1），其 中 男 性 69 例，女 性 31 例，平 均 年 龄（61.9411.76）岁。2.2乙肝肝癌组和非乙肝肝癌组血清甘胆酸、AFP及HBV突变类型比较 非乙肝肝癌组与乙肝肝癌组的血清甘胆酸水平差异无统计学意义，乙肝肝癌组血清AFP水平显著高于非乙肝肝癌组（表1）。乙肝肝癌组BCP区突变率为14%，前C区突变率为23%，其中部分病例存在BCP区和前C区的混合突变，突变率为10%。非乙肝肝癌组也可见1例前C区突变（见表1）和1例HBV DNA突变野生型，这是由于检测方法的局限性造成乙肝突变患者的漏检。2.3HCC患者HBV突变类型与血清甘胆酸、AFP的关系 为了探究HCC患者HBV前C区/BCP区基因突变与血清甘胆酸、AFP之间的潜在关系，我们对100例HBV阳性的HCC患者血清甘胆酸、AFP进行了分类比较。结果表明，HCC患者基因突变组血清AFP显著高于无基因突变组，差异有统计学意义（P=0.003 5），而血清甘胆酸在 HCC患者基因突变组与无基因突变组的差异无统计学意义（P=0.528 5）（表2）。为了探究是哪一种突变造成血清AFP水平的改变，分别对BCP区突变和前C区突变分类统计，结果表明，AFP 的差异仅在 BCP 区 1762/1764 位点有统计学意义（P=0.031 5），在前C区1896/1899位点差异无统计学意义（P=0.092 2）（表2）。表2HBV突变类型与血清甘胆酸、AFP的关系突变类型HBV有突变型HBV无突变型BCP区有突变型BCP区无突变型前C区有突变型前C区无突变型甘胆酸/mgL-16.4866.0897.7079.4648.7607.3207.1188.8437.7206.8717.4148.864AFP/ngL-1711.51193*190.3549.8767.6893.1*266.0781.8579.81207259.3632.3注：*表示P0.05，*表示P0.01。表1两组患者血清甘胆酸、AFP比较组别非乙肝肝癌组乙肝肝癌组P血清标志物HBV甘胆酸/mgL-16.4314.9227.3668.6400.348 7AFP/ngmL-1133.9559.2336.1812.40.041 6HBV突变类型/n（%）BCP区0（0）14（14）/前C区1（1）23（23）/混合0（0）10（10）/12292022 年赣 南 医 学 院 学 报投稿网址：http：/3 讨论 慢性乙肝病毒感染是个全球卫生问题，如果治疗不及时，将从肝炎进展到肝硬化甚至肝癌。研究发现，HBsAg阳性者的肝癌发生风险是HBsAg阴性者的12倍19。对HCC患者做到准确判断、及时治疗和有效监测是HCC治疗的一大难点和重点。甘胆酸被广泛用于肝性疾病的诊断，血清甘胆酸水平的变化反映出肝损伤的动态过程，因此，甘胆酸在HCC诊断中具有潜在价值。遗憾的是，在本研究中，尚未发现甘胆酸在诊断HCC类型和HBV突变之间的相关性。AFP是一种对肝癌敏感的肿瘤标志物，在临床上被广泛用于肝癌的诊断及术后的检测，但AFP的升高不只见于肝癌患者。我们的结果表明，AFP与HCC类型具有潜在相关性，乙肝HCC患者AFP水平显著高于非乙肝HCC患者。在对乙肝HCC患者突变类型进行深入研究，我们发现，前C区突变比例明显高于BCP区突变比例。2012年一项关于西南地区HBV DNA突变的研究表示，在500多份HBV血清标志物阳性的血清中，BCP区突变率和前C区突变率分别为34.1%和39.7%，同期，河北正定县前C区突变为18.1%20。本研究样本的BCP区突变和前C区突变比例均低于西南地区水平，这不仅可能与地域、突变检测试剂盒的敏感性相关，还可能与HBV基因型有关，不同突变类型的比例在不同HBV类型中也有不同。其次，本研究发现HBV突变的 HCC 患者血清 AFP 水平更高，这种差异在BCP区突变组中有统计学意义。BCP区在结构上与HBVx基因有部分重叠，其A/T的突变使得HBVx基因结构更为稳定，这也是突变携带者更易恶化和HCC患者转移的重要因素。值得注意的是，BCP区突变可以增强HBV复制，高水平的血清AFP也反映出肿瘤细胞处于活跃期，两种检测手段是否可以联合应用于HCC的早期诊断还需要后续实验。其次，HBsAg是目前临床上被用来判断HBV感染的重要标志物，也是 WHO公认的关键指标21。免疫学方法是目前临床常用HBsAg筛查的检测方法，具有高灵敏和高特异性。然而 HBV 基因的突变会影响HBsAg的表达或改变其抗原性，造成一定的漏检风险。一项研究发现，中国隐匿性乙肝患者HBsAg的亲水区突变率高达 55.7%22。本研究数据表明，HBsAg阴性的乙肝携带者比例有2%之高。其次，HBV BCP 区/前 C区作为 HBV 的高突变区，对 HCC进展具有密切关系，因此，临床上是否有必要加强对HBV突变类型的检测值得深入探究。参考文献：1 SIEGEL R L，MILLER K D，FUCHS H E，et al.Cancer Statistics，2021J.CA Cancer J Clin，2021，71（1）：7-33.2 RICH N，SINGAL A G.Hepatocellular carcinoma tumour markers:current role and expectationsJ.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2014，28（5）：843-853.3 BARLETTA E，TINESSA V，DANIELE B.Screening of hepatocellular carcinoma：role of the alpha-fetoprotein（AFP）and 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