实验室质控.doc
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1、 第五部分目录 胚胎实验室手册胚胎实验室工作规程 1无菌技术 2设备校准和维护 3实验室质控 5实验室工作流程 6培养液的配置 7取精和精液分析 8精子处理 9精子冷冻和解冻 10取卵和卵子处理 10IVF的授精 11单精子卵胞浆内注射(ICSI) 13胚胎的培养和观察 13囊胚培养 14胚胎移植 15胚胎冷冻和解冻 17辅助孵化 19胚胎着床前诊断(PGD)操作 19实验室人员的职业安全 20病人身份和标本标识 21实验室记录及保密21冻存标本22卵子的捐赠22事故和问题22耗材和管理23设备清单23消耗品清单24试剂清单25手术、实验室温度、湿度、通风25胚胎实验室工作制度实验室人员职责2
2、7实验室人员工作制度27实验室物品管理制度 28实验室仪器维护制度 28实验室消毒隔离制度 28实验室工作程序 29第一部分 实验室质控实验室质控是辅助生殖技术成功的关键。水、培养液、一次性用品、PVP、试剂、矿物油、混合气体的质量和实验室环境的改变可导致配子和胚胎的发育能力降低。质控应能在问题出现之前检测出潜在的问题,当检测到问题时应立即采取措施进行纠正。程序和消耗品在没有评估和权威认可时不能随意更改.一、无菌技术无菌环境对任何细胞培养的成功都是至关重要的。通常采用的方式是使用垂直层流的超净工作台.工作原理:无菌气流的方向为由上而下的。位于无菌气流中的无菌物品可保持无菌,其上方无其他物体的遮
3、盖.操作要点: 确定无菌和非无菌物,分开放置,不将非无菌物放在无菌物上方 无菌物应暴露在无菌空气中 所有无菌操作必须在无菌环境中完成 移液时不要过早打开盖子,将盖子放在工作台的后方,内面朝上,并避免在其上方操作 所有移液管、移液头的前端均不可置于操净台外,应朝向内放置 每天工作结束后用消毒蒸馏水擦拭超净台二、设备校准和维护1。 常规检查和校准项目温度允许温差C02浓度允许浓度差C02培养箱37 C00。5 C05005倒置显微镜恒温载物台37 C00。5 C0/恒温平台与恒温试管架37 C00。5 C0/冰箱保鲜层6 C02 C0/冻臧层12 C02 C0/2.要求: 每日晨同一时间用标准的C
4、02检测仪、温度计来检测C02培养箱内的温度C02浓度。 温度和CO浓度超出设定的界限应向上级汇报,及时处理。 每日结果记录在质控记录本3. 一般维护项目时间维护C02培养箱每月一次清洁消毒污染清洁消毒必要时由供应商保养、再校准恒温平台与恒温试管架每周一次清洁每月一次消毒超净工作台每周一次清洁必要时消毒去污离心机每月一次清沽消毒倒置显微镜与体视镜使用后清洁必要时由供应商保养、校准微量移液器每周一次清洁消毒每三个月送测定所校准冰箱每周一次清洁建有专项记录,每次清洁维护予以记录.4. 具体清洁消毒方法4。1时间安排: 每天 清洁倒置显微镜、体视镜、超净工作台、工作区域 每周 清洁C02培养箱的水托
5、盘,换水 每月 清洁消毒离心机、恒温平台、恒温试管架、清洁培养箱4.2 清洁方法:4.2。1 超净工作台:用消毒蒸馏水擦洗表面后擦干4.2.2 倒置显微镜、体视镜:用消毒蒸馏水擦洗表面后擦干4.2。3 C02培养箱水托盘:把培养箱内物品拿出后取出托盘把水到掉,用沸水冲洗浸泡后用无菌纱布擦干,放回培养箱,倒入无菌蒸馏水至34处,待温度和CO2浓度平衡后使用4。2.4 离心机:将吊桶从转轴中取出,用洗洁精刷洗后在流水下冲净后用75酒精擦拭.用洗洁精、水、75%酒精依次擦洗。后重新装回吊桶4.2.5 恒温平台与恒温试管架:从实验室取出,依次用水、75%酒精、水擦洗,试管架内管用长棉签擦拭,放回室内,
6、装好4.2.6 试管架:浸泡在洗洁精溶液中用刷子擦洗,在水龙头下冲洗,用75酒精擦拭后置于通风处下燥4.2.7 CO2培养箱:把箱内物品取出后拆除内部所有隔板,用沸水冲洗水托盘和隔板后用无菌纱布擦干。用无菌蒸馏水擦拭培养箱内壁及玻璃门。将水托盘放回培养箱,倒入新鲜的无菌蒸馏水,将隔扳重新放回培养箱内,待温度和C02浓度达到平衡后使用4.2.8 各种硅胶管:用酒精浸泡30分钟,用无菌蒸馏水内外冲洗20秒,用无菌蒸馏水浸泡过夜后再用无菌蒸馏水内外冲洗20秒,将管腔内的水分排干.5. 剥离管和移液管的准备和消毒:用经过灭菌和鼠胚实验合格的巴氏吸管。两手握住巴氏吸管的两端,将吸管窄部中央在酒精灯的火焰
7、中烧软,移离火焰后迅速向两边牵拉,形成细长的玻璃管。用火焰将细管在合适直径处烧断,将弃去的断头在火上烧热,在留下的玻璃管中选择合适直径处烫断。在体视镜下检查其直径应为140160um(剥离管)或160-180um(转移管)。三、C02的检测和消耗品检测方 法:精子存活实验用 物:被检测过的培养液和矿物油消耗品,有来自以前受试供者的精液准 备:收集实验当天的精液,液化后用梯度法洗涤后放在无菌离心管中。C02监测:每个培养箱中各放两个精子培养管,并将培养管盖子松开,培养三天新消耗品检测:将新消耗品在适量的培养液中充分暴露,用此培养液与培养器皿收集和培养精子三天.取 样:用移液管混合标本30次后取2
8、0ul精子放入载玻片,在镜下观察,计数200条精子的活力后除2即为最后结果,同一标本重复计数的误差应在10之内。记 数:记录精子最初的浓度、活动力和活动分级,记数培养后精子的活动力和活动分级.结 果:在第三天精子活动率减少20以上提示有毒性物质存在。临界结果需重新测试。实验室定期评估项目间隔时间标准受精率2周60卵裂率2周90种植率1个月10%A级胚胎比率2周20冷冻胚胎解冻复苏率1个月70当发现妊娠率下降时,应检测一些潜在可能影响因素,发现后予以纠正.可能的影响1. 临床改变2. 空气质量3. 实验室清洁工作4. 气体供给和气体质量5. 实验耗材批号改变:矿物油6. 培养箱的校准和稳定性7.
9、 消耗品的改变实验室工作流程上 午打开设备电源,开启恒温设备检查C02气体,C02培养箱的温度和C02浓度,并记录观察室内温湿度并记录准备当日的培养液和消耗品检查前一日的IVF或ICSI受精情况检查受精卵的发育情况取卵,精液处理IVF或ICSI下 午 胚胎冷冻 配置培养液准备消耗品将第二天所需的培养皿放入C02培养箱关掉设备电源清洁设备、工作区域取换垃圾桶 关闭实验室不用的电源培养液的配制 取卵液(HTF-HEPES+HAP):用于冲洗取卵针、收集卵子。含97%HTFHEPES、3HAS、1肝素。 洗卵液(HTF HEPES):用于卵丘复合物和卵子的暂时存放.含97%HTFHEPES、3%HS
10、A。移植液(ET):用于胚胎移植和注射、打孔盘的制作。含90ttTP-HEPES、I0HSA。 培养液(IVCONE):用于卵子、配子及卵裂球的培养.含85 90%IVCONE、15一I0HSA. 囊胚培养液(VCFHREE):用于胚胎囊胚期的培养.含890%IVC THREE、15一I0%HSA。 80分层油:用于精液的洗涤处理。含80分层油、20沈卵液. 40分层油:用于精液的洗涤处理。含40分层油、60取卵液. 透明质酸酶(HY) HY的终浓度为80-100IUML 称量0026g的透明质酸酶溶于10ml新鲜配置的洗卵液,用04Sum的针筒式过滤器过滤后,每25m1分装于5ml的试管中,
11、冷冻保存。 聚碘维酮(PVP) PVP的终浓度为10 称量05g的聚碘维酮溶于5ml新鲜配置的洗卵液,在室温下静置4小时后用04Sum的针筒式过滤器过滤,每04m1分装在1ml的离心管中,冷冻保存。 培养油的制备 目前我中心所用的培养油是SIGMA公司的M8410矿物油。此类矿物油已经过灭菌消毒,但用前还要经过处理.洗油:将矿物油和HTF-HEPES按9:l的比例倒入玻璃质的无菌容器中,摇动瓶子,使液体与油充分混匀。静置于冰箱保鲜层内3天(最长不可超过7灭),使油与液体自然分层。滤油:自然分层后,将上层油置用045um针筒式过滤器过滤在250ml或600ml培养瓶中,置于冰箱保鲜层中保存。平衡
12、:用时须至少提前3天分装于50ml培养瓶中,松开瓶盖置于于C02培养箱中,平衡后方可使用。取精和精液分析 取精应在取卵于术前(1CSI、IVF)或授精的(IUI)2小时进行。 核对病人姓名、病历、身份证后给病人一个取精杯,杯身上要有明确标示。 如取精困难,则通知男科医生,考虑通过外科手术睾丸取精。 尽量要求病人在中心取精,在外取精者需在30分钟内送回。精液分析正常精液标本应质地均匀,呈狄白色,在室温下30分钟即呵自然液化。刖吸管吸起后会呈不连续的小滴落下;不正常的精液标本会显得过于清澈或因有红细胞而呈棕色,或任室温下放置l小时以上仍不液化,用吸管吸起后液滴会形成大丁2CM的长丝。精液的活力分级
13、A级一活力良好,呈直线运动活动B级一活动较好,活动但方向不定C级一活动不良,动作迟缓,原地转动D级不活动,死精子正常精子标准项日正常值且2MLPII7278精子密度2010ML精子总数40106活动率50(A+B)豆霓25%(A级)形念30正常活率75%白细胞l106ML精子处理对于IUI和常规IVF来讲,在精液中获取足够数量的活动精子非常重要。精子处理的过程可去除精浆,从而诱导精子的获能。对于ICSI来讲,尽管只要有活动的精子就可以进行,但适量的精子处理去除精浆和杂质有利于ICSI的操作。新鲜精子处理方法l、梯度法 将80分层油、40分层油、洗卵液、培养液平衡至室温。 存15ml离心管中先后
14、加入80%分层油和40分层油各1m注意动作要轻,不要 扰乱两层的界面。 加入2ml精液。 离心10分钟,转速为18002000转分钟(1410)。 小心吸出上清至沉淀上方0。5一lml处。加入洗卵液3-5ml,轻轻摇匀。离心5分钟,转速为800一1000转分钟. 吸出全部上清液留沉淀(如准备IVF或ICSI至此即可)。 加入培养液至0.5ml,放入培养箱,待用.2、上游法(略)3、直接离心法(略)冷冻精子处理方法 处理方法同上精子解冻法,如为IUI用留沉淀后再加入培养液至0508ml处,放入培养箱,待用即可.不动精子的实验室检测技术 目的:区分D级中的有活性的不动精子用于ICSI办法:低渗溶液
15、法精子的冷冻和解冻冷冻保护液 采用甘油作为冷冻保护液.冷冻方法 精液标本需在完成精液分析和精予处理后l小时内冷冻保存。 冷冻保护液预热至室温。 将精液和等量的冷冻保护液加入Falcon352059培养管内,混匀. 每0608ml的的混合精液装入1支Nunclml冷冻管。 将冷冻管放入已标志的铝支架中置于4C冰箱中l0分钟. 将铝支架置于液氮罐内,距液氮面10-15cm,持续10分钟。 将铝支架置于冷冻提桶中,保存于液氮罐中.解冻方法 洗卵液预热置室温. 确认患者编号、姓名等,从液氮中取出精液冷冻管,再次确认患者编号、 姓名。 将冷冻管在室温下放置56分钟,同时仔细检查冷冻管足否有裂痕或液氮渗漏
16、. 用移液器将全部精液吸入15ml离心管中。 缓慢的逐滴加入洗卵液35ml,每加入一滴后轻轻摇匀. 离心 5分钟,转速为1000转分钟。 吸去上清备用。取卵和卵子处理 通常在注射HCG36小时后经阴道在B超引导下行穿刺取卵,取卵在紧邻胚胎实验室的手术室进行,卵子经穿刺吸取在Falcon 14ML试管中.取卵准备 1打开各恒温板,恒温试管架和体视镜预热。 2将洗卵液倒入Falcon 352059皿中,多少依每人预计卵数而定,但一般在 5l0ml 间,放入C02培养箱中平衡待用。 3取Falcon353002皿待用,并制作ICSI注射盘,放入C02培养箱平衡,等待加入精子。 4将含有肝素的取卵液倒
17、入Falcon352059试管中.一般每支试管中倒入 52ml 5将575英寸巴氏管2支插入黑色橡胶吸头中待用.取卵步骤 1执行无菌操作,及时替换有污染可能的器皿. 2将护士置于恒温试管架中的含卵泡抽吸液的FalCOFI 352059试管中的卵泡液倒入353002中,在体视镜下寻找卵丘复合物。 3找到卵丘复合物后拣出,用巴氏管在当日晨制作的353037外孔中洗涤后放入内孔。 4如卵丘复合物有血块污染应先用1 ml无菌针头将其剥离后再拣出。 5如有异常抽吸液,应在手术最后再处理,并将抽吸液保留转交给手术室护士。 6在卵泡抽吸过程中,将所获得的卵丘复合物及时的放入取卵前一天下午制备的353037皿
18、中,并置于培养箱中培养,一般在获得46个卵丘复合物中就应进行. 7记录取卵开始和结束时间及找到卵丘复合物的数目。培养皿的制作 暂时培养皿:1个,在取卵前1日下午制作,置于C02培养箱中平衡过液,用IVCONE倒入Falcon353037皿的内孔中,液量依预计卵子量而定,但一般不超过5ml。 培养皿:1个,在取卵前一日下午制作,置于C02培养箱中平衡过夜,用IVCONE在Falc。n353037皿中作27个5080ml的培养液滴,盖以矿物油。 注射盘:1个在取卵日晨制作,置于C02培养箱中平衡待用,用移植液和PVP在Falcon353002皿中分别制作多个液滴,盖以矿物油。IVF的授精卵子成熟度
19、的评估形念标准成熟度标志完整或破裂的第一极体,卯细胞可有空泡过熟M+排出第一极体成熟MII未见GV也未排出第一极体未熟M1有一个完整的球型核仁未熟GV授精时间取卵后小时授精步骤1. 从C02培养箱中取出暂时培养皿和调整好精了密度为510ml的精子制备液。2. 用巴氏吸管将卵丘复合物放入培养皿中。3. 用移液滴头吸取精子制备液放入培养皿中,放的过程中要始终对准卯丘复合物。4. 在倒置显微镜下检查精子密度,每200倍视野的活动精子数应为2040个。5. 将培养皿放回培养箱6. 记录卵丘复合物的数日和成熟度。7. 次日晨用转移管将卵了拣出,在洗卵液中洗涤后放入前一日制备的353801皿中。8. 在倒
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