右美托咪定调控Nrf2_H...细胞氧化应激损伤的作用研究_钱厚霖.pdf
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1、中国现代医学杂志China Journal of Modern MedicineVol.33 No.7Apr.2023第 33 卷 第 7 期2023 年 4 月右美托咪定调控Nrf2/HO-1通路对H2O2诱导心肌细胞氧化应激损伤的作用研究*钱厚霖1,周述芝2,毕小波1,龙翔1(1.西南医科大学附属医院 麻醉科,四川 泸州 646000;2.雅安市人民医院 麻醉科,四川 雅安 625000)摘要:目的探讨右美托咪定调控核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶1(HO-1)通路对过氧化氢(H2O2)诱导心肌细胞氧化应激损伤的作用。方法体外培养大鼠H9C2心肌细胞,设置对照组、H2O2组、
2、1 mol右美托咪定+H2O2组、5 mol右美托咪定+H2O2组、10 mol右美托咪定+H2O2组。CCK-8法检测各组H9C2细胞增殖情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组H9C2细胞丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测各组H9C2细胞Nrf2、HO-1 mRNA相对表达量;Western blotting检测各组H9C2细胞Nrf2、HO-1蛋白相对表达量。结果与对照组比较,H2O2组H9C2细胞存活率、SOD水平、Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白相对表达量降低,MDA水平升高(P 0.05);与H2O2组比较,1 mo
3、l右美托咪定+H2O2组、5 mol右美托咪定+H2O2组、10 mol右美托咪定+H2O2组H9C2细胞存活率、SOD水平、Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白相对表达量均升高,MDA水平降低(P 0.05),且呈右美托咪定浓度依赖性。结论右美托咪定可能通过激活Nrf2/HO-1通路,发挥对H2O2诱导心肌细胞氧化应激损伤的保护作用。关键词:缺血性心脏病;心肌细胞;氧化应激损伤;右美托咪定;核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1通路中图分类号:R542.2;R965.1文献标识码:AEffect of dexmedetomidine regulating Nrf2/HO-1 pathway on
4、 H2O2-induced oxidative stress injury in cardiomyocytes*Qian Hou-lin1,Zhou Shu-zhi2,Bi Xiao-bo1,Long Xiang1(1.Department of Anesthesiology,Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China;2.Department of Anesthesiology,Yaan Peoples Hospital,Yaan,Sichuan 625000,China)Ab
5、stract:Objective To investigate the effect of dexmedetomidine on hydrogen peroxide(H2O2)-induced oxidative stress injury of cardiomyocytes by regulating the nuclear factor erythroid 2 related factor 2(Nrf2)/heme oxygenase-1(HO-1)pathway.Methods Rat H9C2 cardiomyocytes were cultured in vitro,and the
6、control group,H2O2 group,1 mol dexmedetomidine+H2O2 group,5 mol dexmedetomidine+H2O2 group,10 mol dexmedetomidine+H2O2 group were set up.The proliferation of H9C2 cells was detected by CCK-8 method;the levels of malondialdehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)in H9C2 cell culture medium were detect
7、ed by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA);the expressions of Nrf2,HO-1 mRNAs in H9C2 cells were detected by real-time fluorescent quantitative PCR(qRT-PCR);and the expressions of Nrf2,HO-1 proteins in H9C2 cells were detected by Western blotting.Results Compared with the control group,the H9C2
8、cell survival rate,SOD level,Nrf2 mRNA,HO-1 mRNA,HO-1 protein expression levels in H2O group were decreased,and MDA level 实验研究 论著DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2023.07.007文章编号:1005-8982(2023)07-0040-06收稿日期:2023-01-19*基金项目:四川省医学(青年创新)科研课题项目(No:S21033)40第 7 期钱厚霖,等:右美托咪定调控Nrf2/HO-1通路对H2O2诱导心肌细胞氧化应激损伤的作用研
9、究were increased(P 0.05);compared with H2O group,the H9C2 cell survival rate,SOD level,Nrf2,HO-1 mRNA and protein expression levels in 1,5,10 mol dexmedetomidine+H2O2 groups were increased,and MDA level were decreased(P 0.05);and dexmedetomidine was concentration-dependent.Conclusion Dexmedetomidine
10、can protect cardiomyocytes from H2O2-induced oxidative stress injury by activating Nrf2/HO-1 pathway.Keywords:ischemic heart disease;cardiomyocytes;oxidative stress injury;dexmedetomidine;nuclear factor erythroid 2 related factor 2/heme oxygenase-1 pathway缺血性心脏病指由于冠状循环改变、冠状动脉血流与心肌需求间不平衡而导致心肌发生损伤的心脏病
11、1。临床上主要采用再灌注治疗缺血性心脏病,但血流再灌后会加重心肌组织损伤,即发生 心 肌 缺 血/再 灌 注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤2。氧化应激是再灌注损伤中最重要的病理机制之一,它通过多种途径引起心肌细胞凋亡、自噬、炎症等损伤,从而引起不可逆的心肌细胞损伤和心功能障碍3。研究报道,心肌细胞氧化应激损伤涉及到多个生物学过程,如核因子 E2 相关因子 2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2,Nrf2)/血红素加氧酶 1(heme oxygenase-1,HO-1)通路的过度激活4。Nrf2/HO-1 通路是细胞内
12、参与抗氧化应激的重要通路,氧化应激过度激活后,氧自由基增多,刺激Nrf2 表达上调,并识别 HO-1 的抗氧化反应元件,并启动 HO-1 表达,发挥抗氧化作用5。右美托咪定是一种2肾上腺素能受体激动剂,在麻醉、重症监护治疗中发挥镇静、镇痛作用,近年来研究发现,其对I/R过程具有保护作用6-7。此外,对Nrf2/HO-1 通路的激活是右美托咪定发挥抗氧化作用的重要机制8。本研究采用过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)诱导心肌细胞氧化应激损伤,探讨右美托咪定对此过程的影响,并分析其潜在机制。1 材料与方法1.1细胞、试剂与仪器大鼠 H9C2 细胞(美国模式培养物集存库,货号:F
13、B0673)。DMEM 培养基(德国 Merck KGaA 公司,货号:KL-P0032),右美托咪定注射液(江苏恩华药业股份有限公司),CCK-8 试剂(日本同仁化学研究所,货号:CK-04),丙二醛(MDA)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(武汉亚科因生物科技有限公司,货号:ABB-KTE71091-48T),超氧化物歧化酶(SOD)ELISA 试剂盒(英国 Abbexa 公司,货号:abx585004),兔一抗 Nrf2、HO-1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(英国 Abcam 公司,货号:ab89443、ab13243、ab181602),山羊抗兔二抗(美国 Santa 公
14、司,货号:0295G-HRP)。ABI 7500 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)仪(美国 Applied Biosystems公司),MODEL550 酶标仪、ChemiDocXRS 化学发光成像系统(美国Bio-Rad公司)。1.2方法1.2.1 细胞培养与分组 H9C2细胞在含有10%胎牛血清和1%青/链霉素的DMEM培养基中于37、5%二氧化碳的培养箱中培养。待细胞生长到对数生长期后,将H9C2细胞接种于6孔培养板中(1105个/孔),分为对照组、H2O2组(200 mol/L 的H2O2处理 24 h)、1 mol/L 右美托咪定+H2O2组(用终浓度为 1 mol/L 右
15、美托咪定的 DMEM 培养基预处理 30 min 后,用 200 mol/L 的 H2O2处理 24 h)、5 mol 右美托咪定+H2O2组(用终浓度为 5 mol/L右美托咪定的 DMEM 培养基预处理 30 min 后,用200 mol/L的H2O2处理24 h)、10 mol右美托咪定+H2O2组(用终浓度为10 mol/L右美托咪定的DMEM培养基预处理30 min后,用200 mol/L的H2O2处理24 h)。对照组用含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基培养。每组设6个复孔。1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖 培养 48 h 后,将各组 H9C2 细胞用 CCK-8 试剂孵育
16、 2 h,酶标仪检测光密度(OD)值,细胞存活率(%)=OD处理组/OD对照组100%。1.2.3 ELISA检测细胞MDA、SOD水平 收集各组细胞培养液,采用 ELISA 法检测 MDA、SOD 水平,酶标仪检测各孔 OD 值,根据标准品绘制标准曲线,并计算MDA、SOD水平。1.2.4 qRT-PCR 检测细胞 Nrf2、HO-1 mRNA 表达 用 TRIzol 试剂提取细胞总 RNA,逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA,然后进行扩增。反应体系:正反向引物各 0.5 L,10cDNA 模板 1 L,2SYBR mix 10 L,ddH2O 8 L。扩 增 条 件:41中国现代医学杂志
17、第 33 卷 95 预变性 5 min,95 变性 15 s,55 退火 30 s,60 延伸 1 min,40 个循环。GAPDH 为内参基因。Nrf2 正向引物:5-CGGTATGCAACAGGACATTG-3,反向引物:5-TCTGTCAGTTTGGCTTCTGG-3,引物长度:119 bp;HO-1正向引物:5-AAGACTGCGTTCCTGCTCAAC-3,反向引物:5-AAAGCCCTACAGCAACTGTCG-3,引物长度:90 bp;GAPDH 正向引物:5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3,反向引物:5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3,引物长度:109 b
18、p;采用 2-Ct法计算 Nrf2、HO-1 mRNA 相对表达量。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。1.2.5 Western blotting检测细胞Nrf2、HO-1蛋白表达 RIPA裂解液提取H9C2细胞总蛋白,对总蛋白浓度进行定量后,电泳分离等量蛋白样品并转膜。5%脱脂奶粉于室温下封闭膜 1 h 后,加入 1500稀释一抗(Nrf2 抗体、HO-1 抗体、GAPDH 抗体),4孵育过夜,加 15 000 稀释的二抗,室温孵育1 h,显色,拍照,采用 Image J 软件分析条带灰度值,计算Nrf2、HO-1蛋白相对表达量。1.3统计学方法数据分析采用 SPSS 24.0 统计软
19、件,计量资料以均数标准差(xs)表示,多组间比较用单因素方差分析,两两比较用SNK-q检验。P 0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1各组H9C2细胞存活率比较对照组、H2O2组、1 mol 右美托咪定+H2O2组、5 mol 右美托咪定+H2O2组、10 mol 右美托咪定+H2O2组的 H9C2 细胞存活率比较,差异有统计学意义(P 0.05)。进一步两两比较,结果:与对照组比较,H2O2组 H9C2 细胞存活率降低(P 0.05);与H2O2组比较,1 mol右美托咪定+H2O2组、5 mol右美托咪定+H2O2组、10 mol 右美托咪定+H2O2组H9C2细胞存活率升高(P 0
20、.05);10 mol右美托咪定+H2O2组 H9C2 细胞存活率高于 1 mol 右美托咪定+H2O2组、5 mol右美托咪定+H2O2组(P 0.05);5 mol 右美托咪定+H2O2组 H9C2 细胞存活率高于1 mol右美托咪定+H2O2组(P 0.05)。H9C2细胞存活率呈浓度依赖性。见表1。2.2各组H9C2细胞MDA、SOD水平比较对照组、H2O2组、1 mol 右美托咪定+H2O2组、5 mol 右美托咪定+H2O2组、10 mol 右美托咪定+H2O2组的 H9C2 细胞 MDA、SOD 水平比较,差异有统计学意义(P 0.05)。进一步两两比较,结果:与对照组比较,H2
21、O2组 H9C2 细胞 MDA 水平升高,SOD 水平降低(P 0.05);与 H2O2组比较,1 mol右美托咪定+H2O2组、5 mol右美托咪定+H2O2组、10 mol 右美托咪定+H2O2组 H9C2 细胞 MDA 水平降低,SOD 水平升高(P 0.05);10 mol 右美托咪定+H2O2组 H9C2 细胞 MDA 水平低于 1 mol 右美托咪定+H2O2组、5 mol 右美托咪定+H2O2组(P 0.05),SOD 水平高于 1 mol 右美托咪定+H2O2组、5 mol右美托咪定+H2O2组(P 0.05);5 mol右美托咪定+H2O2组 H9C2 细胞 MDA 水平低于
22、 1 mol 右美托咪定+H2O2组(P 0.05),SOD 水平高于 1 mol右美托咪定+H2O2组(P 0.05)。随着右美托咪定浓度升高,H9C2 细胞 MDA 水平降低,SOD 水平升高。见表2。2.3各组H9C2细胞Nrf2、HO-1 mRNA表达比较对照组、H2O2组、1 mol 右美托咪定+H2O2组、5 mol 右美托咪定+H2O2组、10 mol 右美托咪定+H2O2组的 H9C2 细胞 Nrf2、HO-1 mRNA 相对表达量比较,差异有统计学意义(P 0.05)。进一步两两比较,结果:与对照组比较,H2O2组H9C2细胞Nrf2、HO-1 mRNA相对表达量降低(P 0
23、.05);与 H2O2组比 较,1 mol 右 美 托 咪 定+H2O2组、5 mol 右美托咪定+H2O2组、10 mol 右美托咪定+H2O2组 H9C2细胞 Nrf2、HO-1 mRNA 相对表达量升高(P 0.05);表 1各组H9C2细胞存活率比较(%,xs)组别对照组H2O2组1 mol右美托咪定+H2O2组5 mol右美托咪定+H2O2组10 mol右美托咪定+H2O2组F 值P 值细胞存活率100.000.0036.484.1358.725.9570.067.5284.778.5397.7460.000注:与对照组比较,P 0.05;与 H2O2组比较,P 0.05;与1 mo
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