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细胞凋亡的检测 生 64 范泓洋 2006030003 1 细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测 实验人：生 64 范泓洋 2006030003 同组实验：刘婧娟 实验日期：2008 年 5 月 8 日 1.1.实验目的实验目的 1.1 了解细胞凋亡的基本概念及其意义 1.2 了解细胞凋亡的诱导及检测方法，学会区分凋亡不同阶段的细胞 1.3 学习 Hoechst33258 染色方法 2.2.实验原理实验原理 细胞凋亡(apoptosis)或程序化细胞死亡(programmed cell death,PCD)，是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，并强调这一过程是一种自然的生理学过程。由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以又被称为程序化细胞死亡。通过细胞凋亡，机体得以消除不再需要的细胞，而不引起炎症反应。细胞凋亡有确保正常生长、发育，维持内环境稳定，发挥积极的防御功能的作用。凋亡过程中的细胞在形态学和很多生化指标上与正常细胞和坏死的细胞都有明显区别。区别点区别点 细胞凋亡细胞凋亡 细胞坏死细胞坏死 起因起因 生理或病理性 病理性变化或剧烈损伤 范围范围 单个散在细胞 大片组织或成群细胞 细胞膜细胞膜 保持完整，一直到形成凋亡小体 破损 染色质染色质 凝聚在核膜下呈半月状 呈絮状 细胞器细胞器 无明显变化 肿胀、内质网崩解 细胞体积细胞体积 固缩变小 肿胀变大 凋亡小体凋亡小体 有，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬 无，细胞自溶，残余碎片被巨噬细胞吞噬 基因组基因组DNA DNA 有控降解，电泳图谱呈梯状 随机降解，电泳图谱呈涂抹状 蛋白质合成蛋白质合成 有 无 调节过程调节过程 受基因调控 被动进行 炎症反应炎症反应 无，不释放细胞内容物 有，释放内容物。Hoechst33258 为特异性 DNA 染料，与 A-T 键结合，但在 pH2.0 环境下则优先与RNA 结合，染色 DNA 时应调整染液的 pH 至 7.0，这种染料不溶于磷酸缓冲液；所以配制时必须先以蒸馏水溶解配成储存液在 4中避光保存。细胞凋亡的检测 生 64 范泓洋 2006030003 2 3.3.实验材料、试剂及器械实验材料、试剂及器械 3.1 材料：Hela 细胞 3.2 试剂：H2O2溶液，DMEM 培养基，PBS 溶液，胰酶-EDTA 溶液，Hoechst33258染料，甲醇 3.3 器械：离心机，EP 管，pippet，正置荧光显微镜，盖玻片，载玻片，镊子 4.实验步骤 4.1 向传代 24 小时后的 Hela 细胞系（DMEM 培养液 1ml，贴壁 50%）中加入100lH2O2溶液，继续培养 24 小时 4.2 收集细胞(200uL 胰酶 37消化 2min 后，再加入 1mL 培养基)至 1.5mL EP 管，1000g 离心 5min 4.3 吸出上清，于沉淀中加入 100uL 甲醇，室温固定 10min 4.4 1000g 离心 5min 4.5 弃上清，加 100uL PBS 洗涤沉淀细胞 4.6 1000g 离心 5min，4.7 弃上清，加 40uL PBS 和 10uL Hochest33258 染液，于 37染色 10min 4.8 1000g，离心 5min 4.9 弃上清，加 100uL PBS 洗涤；4.10 1000g，离心 5min 4.11 弃上清，加 15uL PBS 重悬细胞 4.12 取 15uL 悬液于玻片上并于正置荧光显微镜下观察并选取典型凋亡阶段的细胞拍照 5.5.实验结果实验结果 由于 Hoechst33258 染色法只能将细胞核染色，所以只能由核质的形态变化来推测正在凋亡的细胞处于哪一个凋亡阶段。如图 1 所示，细胞核质明显分散，细胞开始边集化。图 1.凋亡过程中的 Hela 细胞。在 10*40 倍镜下观察，明显可见被 Hoechse33258 染色的细胞核成颗粒状分散在细胞内，形成一簇亮点。细胞凋亡的检测 生 64 范泓洋 2006030003 3 图 2.凋亡过程中的 Hela 细胞。在 10*40 倍镜下观察，细胞核固缩成普通细胞细胞核的 1/3，其亮度有明显增加。图 3.凋亡过程中的 Hela 细胞。在 10*40 倍镜下观察，细胞和已经分散成几部分，有部分区域染色明显加深，为核质固缩区域，其余部分染色较暗且模糊，调整焦平面可获得更好的观察效果，可见细胞的立体性。6.6.思考与讨论思考与讨论 6.1 影响凋亡诱导的因素：细胞生长状况：诱导前应观察细胞生长状况，如果细胞活力较旺盛则可以选择进行凋亡诱导，但如果细胞生长状态较差则应该选择换培养基继续培养，因为诱导剂对细胞有很大的伤害，生存状态本来就不好的细胞很可能由于诱导剂的引入而直接坏死而不进入程序性死亡的过程。诱导剂：本实验用的是 H2O2进行凋亡诱导，对人体伤害不大，不是特异性诱导凋亡的试剂。如果加如诱导剂不均匀则会发生浓度高的地方细胞大部分死亡而浓度低的地方细胞基本没有诱导成功的现象。不同细胞和不同的诱导剂对凋亡诱导效果有影响。6.2 为什么很难见到凋亡小体？我认为凋亡小体因为质量较小，在离心过程中可能悬浮在上清液中被吸弃了，或者因为附着力不够，在第一步 PBS 清洗的过程中就被洗掉了。通过查资料得知凋亡小体有双层核膜及内质网和线粒体与深染的染色质，是可以被染色的，不会因为染色的原因而不被观察到。可以考虑直接在培养皿上进行染色，或者先酶消化，然后收集细胞后直接染色，不抛弃任何培养基。7 7 参考资料参考资料 【1】王宏英等，细胞生物学实验指导，清华大学生物科学与技术系，2007 年 正在凋亡的 Hela 细胞