仪器分析及波谱分析实验（教科书）.pdf

0 仪器分析及波谱分析实验 仪器分析及波谱分析实验 1目目 录录 实验一 原子发射光谱定性半定量分析 2 实验二 火焰原子吸收分光光度法测定粮食中铜锌含量 7 实验三 原子荧光光谱法测定环境水样中的砷 9 实验四 用离子选择性电极测定自来水中氯的含量 11 实验五 维生素 B12在玻碳电极上的伏安行为及测定 13 实验六 配合物的组成及其稳定常数的测定 17 实验七 荧光分光光度法测定诺氟沙星片的含量 22 实验八 红外光谱法鉴定有机化合物结构 27 实验九 环糊精/4-羟基香豆素相互作用的紫外光谱及衍生荧光法测定肉制品中痕量亚硝酸盐 33 实验十 气相色谱性能测定及条件选择方法 36 实验十一 混合物的气相色谱定性定量分析 39 实验十二 气相色谱法分析汾酒条件选择 43 实验十三 混合维生素 E 的正相 HPLC 分析条件的选择 46 实验十四 有机化合物的核磁共振氢谱的测定 50 实验十五 有机化合物核磁共振碳谱的测定 53 实验十六 气质联用仪对未知物的检测 56 实验十七 图谱解析实验根据谱图，推定未知苯系物的结构 61 实验十八 火焰光度法测定钾、钠 62 2实验一实验一 原子发射光谱定性半定量分析原子发射光谱定性半定量分析 一、目的一、目的 掌握发射光谱定性半定量分析方法之基本操作，用铁光谱比较法判别未知试样中所含元素及其含量范围。二、原理二、原理 每一种元素因其原子结构不同，受激发后都可以产生自己的特征光谱，每一种元素的特征光谱通常包含有很多谱线，谱线的强度各不相同。一个试样如含有若干种元素，谱线上就有这若干种元素的特征光谱，特征光谱的条数多少与各元素含量高低有关。当某元素含量降低时，其光谱中的弱线相继消失，而不被检出。最后消失的几条谱线叫“灵敏线”定性分析一般只需找出某元素的灵敏线（一般为 23 条）即可确定该元素的存在。辩认谱片上的谱线是哪种元素的常用方法是铁光谱比较法。铁光谱比较法：在同一感光板上并列地摄取样品光谱和铁光谱，将所得谱片放在铁谱图上标有各元素灵敏谱线相应的位置。根据试样谱线和元素光谱图上的元素灵敏谱线相重合的情况，就可直接判定有关谱线的波长及所代表的元素。常用的光谱半定量的分析方法：谱线强度比较法（比较光谱法）将预先配制的标准样品与试样按确定的分析条件同时摄在一张谱片上，在映谱仪上观察谱片上分析线的黑度。如试样光谱中这一谱线的黑度与某一标准样品相同，则试样中这一元素含量与这一标准样品相等。此方法要求试样组成与标准样品相似。谱线呈现法，被测元素的谱线数目随含量增加而增多，含量很低时，仅有 12 条最灵敏线出现，随着试样含量的增高，一些次灵敏线也逐渐出现。因此可在确定的实验条件下用标准样品把元素含量和相应出现的谱线编成谱线呈现表。分析试样时，利用谱线呈现表可以很快地估计出样品中某元素的半定量结果。三、仪器与试剂三、仪器与试剂 摄谱仪 NC28 型摄谱仪 光源 岛津万能光源 3映谱仪 电极 光谱纯石墨电极 纯铁电极 停表、玻璃刀、切板架 感光板（天津 II 型）四、显影液、定影液实验步骤四、显影液、定影液实验步骤 1、准备电极 纯铁电极用砂轮磨去氧化层，并磨成圆锥形，电极头表面要光滑对称。石墨电极：上电极圆锥形，下电极有孔（孔深 46mm）2、装样品 样品装入电极孔内，注意样品装满压紧。3、装干板 将干板、暗盒、玻璃刀、切板架一起带到暗室。打开暗盒，开红灯关白灯，取出干板乳剂面向下，放于切板架上，裁成与暗盒相等的尺寸，乳剂面向下放进暗盒里盖好，开白灯。4、摄谱 1）将暗盒装于摄谱仪上，拉出暗盒挡板。2）铁电极装电极架上，开对光灯调上、下极位置。3）调狭缝 5u，遮光板 5mm，板移 50，光阑推到|258|处的 2 上，接通 220V、110V 电源，接下黑色电键“START”，调电流 3A，燃弧，开快门同时按停秒，曝光 5 秒，停止燃弧。4)换为石墨电极，板移不变，推光阑至|3|电流 3A 燃弧。曝光 20 秒，调大电流为 10A，光阑推至|4|继续曝光 40 秒，接下红色电键停止燃弧。5、换新的石墨电极。其它条件不变。推光阑至|6|和|7|，在低电流和高电流下重复对该样品摄谱。6、暗室操作 在红灯下从暗盒中取出摄好谱的干板，乳剂面向上放入 1820的显影液中，显影 2 分钟半。定影 2 分钟。半定影 8 分钟，取出用水充分冲洗晾干。7、识谱（铁光谱比较法）1）谱片置于映谱仪置片台上 4按如下要求做好记录 电 流 曝光（秒）光 阑 板 移 铁 光 谱 3A 5 2 50 样品（一次）3A 20 3 50 样品（一次）10A 40 4 50 铁 光 谱 3A 5 5 50 样品（二次）3A 20 6 50 样品（二次）10A 40 7 50 铁 光 谱 3A 5 8 50 2）接通映谱仪电源 3）调整物镜使谱片谱线象清晰 4）使用谱线图（共 13 张），将图中的铁谱线与铁谱片上铁谱线相重合。如果样品中欲测元素的谱线与谱线图中已标明的某元素谱线出现的位置相重合，则该元素可能存在从谱线表中知该元素这一谱线没有另外元素谱线干扰。可确认该元素存在于样品中。否则，应进行下列步骤。5）继续查找该元素的其它灵敏线和特征谱线组是否出现，一般有两条以上的灵敏线出现才能确认该元素存在。6）了解该元素灵敏线可能干扰的情况。从谱线表中查出可能干扰的元素。在这些元素中首先排除掉那些在工作的光源条件下不可能被激发的元素和由于样品的特点不可能存在的元素。7）其余可能干扰的元素，应逐个检查它们的灵敏线，如某元素的灵敏线光谱中没有，则认为不存在这个元素的干扰。如在光谱中有其灵敏线，可能是分析元素谱线上叠加干扰元素的的谱线。在这种情况下，进行下一步骤，以期得出肯定判断。8）在该线附近再找出一条干扰元素的谱线（与原干扰强度相同或稍强一些）进行比较，如该分析元素灵敏线黑度大于或等于找出的干扰元素谱线的黑度，则可判定分析元素存在。例：样品中含铁量高时。则锆 343823A 被铁 343831A（强度 10）所重叠，可与铁 343795A（强度 15）的黑度比较，如锆 343823A 的黑度大于或等于铁 343795A 时可确定锆的存在，又如钼 3170347A 与铁3170346A 重叠时，可用铁 3171663A 的黑度比较，确定钼是否存在。附录 6 哈特曼光阑（Hartmann）由金属片制成。置干狭缝前导槽内。光阑移动时，光阑上的不同方孔截取狭缝的上下不同部位。因而能使摄得的光谱落在感光板的不同位置上。由于狭缝的位置没变。而只是光阑对其不同高度的 5截取。则所得该组光谱的谱线位置固定不变。便于定性查找。暗室处理 感光板上的乳剂经曝光后，要经过显影，定影、水洗和干燥等过程，才能获得一张可见的谱片。显影液配方 水（3545）700ml 米吐尔（对位硫酸甲基氨基苯酚）1 克 无水亚硫酸钠（化学纯）36 克 海德路（对苯二酚）5 克 无水碳酸钠（化学纯）2 克 溴化钾（化学纯）1 克 加水稀释至 1000 毫升（上述溶液过滤后，贮于棕色瓶）定影液 水（3540）600ml 海波（硫代硫酸钠、化学纯）240 克 无水亚硫酸钠（化学纯）15 克 冰醋酸 15 毫升 硼酸 75 克 钾明矾 加水至 1000 毫升（过滤后使用）显影注意事项 1、在暗红灯下进行，温度控制在 20;2、乳剂面向上，显影液充分浸没干板乳剂；3、显影过程中要轻轻摇动显影盘，要避免局部浓度不均匀。4、显影液不要长时间放置空气中，用完后小心倒回瓶中。定影注意事项：1、乳剂面向上；2、在 204的范围内进行；3、定影至乳剂透明，再延长一倍的时间，我们规定 8 分钟；64、定影液用后倒回瓶内，不可久置盘中。水洗和干燥注意事项 1、要充分冲洗，把乳剂面上的定影液全部洗去，一般 1.015 分钟。2、水流不可过急，也不可直冲感光板表面，以免冲坏乳剂；3、水洗后的干板放于谱片架上自然干燥，也可用吹风机吹干（用冷风吹）7实验二实验二 火焰原子吸收分光光度法测定粮食中铜锌含量火焰原子吸收分光光度法测定粮食中铜锌含量 一、实验目的一、实验目的 通过本实验了解原子吸收法基本原理及仪器的使用 二、基本原理二、基本原理 原子吸收法是基于从光源发射的被测元素的特征辐射通过样品原子蒸气时，被蒸气中待测元素基态原子吸收，由辐射减弱的程度以求得样品中被测元素的含量。三、仪器和试剂三、仪器和试剂 1、仪器 AA6650 型原子吸收分光光度计 （日本岛津公司）2、试剂 Cu、Zn 标准贮备液 Cu 准确称取 1.000 克铜（光谱纯）于 50ml 烧杯中，加 1：1 硝酸 10ml，加热溶解后，煮沸，冷却后转移到 1000ml 容量瓶中，用水稀释至刻度，浓度为 1mg/mL。Zn：准确称取 1.0000 克 Zn（光谱纯）于 50 mL 烧杯中，加 1：1 盐酸 10ml，溶解后加浓盐酸 5ml，转移 1000ml 容量瓶中，用水稀释至刻度，浓度为 1mg/mL。标准工作溶液的配制将 Cu 和 Zn 标准贮备液用逐级稀释法配成下列标准系列 Cu：Cu：0.5 1.0 3.0 5.0g/ml Zn：1.0 2.0 3.0 4.0g/ml 试样溶液的配制 将 5 克粮食在马弗炉内烧成灰分，用 1：100 硝酸溶解，并定溶于 50 ml 容量瓶中，摇匀待测。四、实验步骤四、实验步骤 1、先开空乙压缩机及乙炔钢瓶，调整压力为：空气：0.350.40MPa，乙炔：0.10.15MPa。2、接通电源，打开主机电源开关，开启后，鸣叫三声表示仪器正常。3、打开计算机，按如下步骤设置分析参数；3.1 启动 AA 软件，选择 Wizard 进入参数设定。83.2 元素选择，选择分析元素 3.3 制备参数 输入样品制备参数 3.4 样品标识符 输入样品标识 3.5 样品选择 选择需要测试的样品 3.6 连接主机/发送参数 3.7 光学参数 选择测定有关光学参数 3.8 燃烧器/气体流量设置 选择适宜的仪器条件 3.9 参数设置完成开始样品测定。3.10 测定完毕用蒸馏水喷雾约 23 分钟。3.11 测定完毕，打印测定结果，关机。五、讨论五、讨论 1、用火焰原子吸收分析法测定时，试样溶液在火焰中经过一系列什么变化来达到测定的目的？2、每一种元素都有若干条波长各不相同的分析线，在实验中根据什么来选择？9实验三实验三 原子荧光光谱法测定环境水样中的砷原子荧光光谱法测定环境水样中的砷 一、实验目的一、实验目的 1.掌握原子荧光光度法的基本原理；2.了解原子荧光光度计的基本操作。二、实验原理二、实验原理 在盐酸介质中，以硼氢化钾作还原剂，使砷生成砷化氢。以氩气作载气将砷化氢导入石英炉原子化器进行原子化，以砷特种空心阴极灯作激发光源，使砷原子受光辐射激发产生电子跃迁，当激发态的电子返回基态或较低能态时即发出荧光，砷浓度在一定范围内与荧光强度成正比。三、材料与方法三、材料与方法 1.仪器及工作条件 AFS3100 型荧光光谱仪（北京海光仪器）仪器工作条件：负高压：300V；灯电流：总电流 50mv 主辅阴极各 25mv；原子化高度：8mm；载气：300mL/min；屏蔽气：900mL/min 容量瓶 100mL 移液管 1mL 三个、5mL 一个 2.主要试剂 As 标准储备液：取 1mLAs 单元素标准溶液（国家标准物质中心）1000g/mL 稀释至 100mL 容量瓶中。2%KBH4溶液：准确称取2.0 g KBH4 置于100mL 4 g/L的KOH溶液中，临用时现配。5%盐酸水溶液 5%硫脲和 5%抗坏血酸的混合液 所有试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。3.样品溶液的制备 准确量取过滤后的环境水样 5mL 于 100mL 容量瓶中，加入 10mL 1：1 盐酸，加入 40mL 硫脲-抗坏血酸混合溶液,用二次蒸馏水定容，摇匀后静置 30 分钟即可测定砷。同时测定试剂空白。4.标准溶液的配制 砷标准工作液 1g/mL：取 10mL 砷标准储备液稀释至 100mL 容量瓶中。分别移取 1g/mL 的砷标准工作液 0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mL 于 100mL 容量瓶中,加入 10mL 101：1 盐酸，加入 40mL 硫脲-抗坏血酸混合溶液,用二次蒸馏水定容，摇匀后静置 30 分钟即可测定。四、实验步骤四、实验步骤 1、仪器操作（1）安装砷空心阴极灯,确认水封中有水;（2）打开主机电源，进入 AFS-3100 型原子荧光光度计工作软件并设置工作条件;（3）进行灯位置和原子化高度的调整;（4）打开氩气瓶旋钮,确认氩气出口压力为 0.25Mpa;（5）点火预热 30 分钟;（6）对“文件”菜单中气路自检、断续流动和自动进样器自检、空心阴极灯和检测电路自检、串行通信检测四项进行检测;（7）点击“文件”菜单中生成新数据库,在“文件名”栏中输入新数据库的名字,单击“保存”.2、标准系列的测定（1）将配制好的标准系列溶液按自动进样程序所设置的位置放在样品盘中;（2）点击工作软件中“空白”按钮中标准空白,进行标准空白溶液的测定;（3）点击“标准”按钮中标准曲线测定,进行标准系列溶液的测定;（4）冲洗(点击“运行”菜单中样品测试).3、未知样品的测定（1）将配制好的未知样品溶液按自动进样程序所设置的位置放在样品盘中;（2）点击“空白”按钮中样品空白,进行样品空白的测定;（3）按样品个数对“样品测量数据”表中“标识”进行编号,点击“样品”按钮中样品测定,进行样品溶液的测定.4、关机操作（1）用蒸馏水对仪器管路进行清洗;（2）熄火并退出工作软件,关闭氩气、计算机和主机.五、实验结果及数据处理五、实验结果及数据处理 环境水样中砷的含量 w（%）=样品中砷的浓度（g/L）稀释倍数 六、思考题六、思考题 1.简述原子荧光法的基本原理？2.你知道的砷的测定方法有哪些？11实验四实验四 用离子选择性电极测定自来水中氯的含量用离子选择性电极测定自来水中氯的含量 一、目的一、目的 通过用离子选择电极分别按照直接电位法和电位滴定测定自来水中氯的含量，掌握这两种测定方法。熟悉精密酸度计的使用，了解计算机在分析化学中的应用。二、方法原理二、方法原理 1、直接电位法 工作曲线法 由于离子选择电极的电极电位与浓度的负对数成线性关系，所以 E=K2.303 若以氯离子浓度的负对数作横坐标，以对应的电位值作纵坐标，按如上关系作出工作曲线，则由测出的未知液的电位值可通过工作曲线求得其浓度。标准加入法 设 Ex 为未知液的电位，Es 为未知液中加入标准液后的电位，未知液体积为 Vx，浓度为 Cx，标准液体积为 Vs，根据下列公式可以计算 Cx。式中E=EsEx K 为工作曲线的斜率。2、电位滴定法 电位滴定法是根据滴定过程中指示电极电位的变化来确定终点的滴定方法。本实验利用沉淀反应：Ag+C1-=AgC1 用 AgNO3作滴定剂，在滴定过程中，C1-离子浓度发生变化，电极电位也随之变化，特别在等当点附近离子浓度变化较大，电极电位也有较大改变，这种电位突跃值可指示滴定终点。可以绘出 EV 图或 图来表明滴定终点。三、仪器和试剂三、仪器和试剂 pHS2 型酸度计 电磁搅拌器 acl nF RT log 1)110(Cx=KEVxVsCsVVE 12氯离子选择电极（在 10-3M 的 CI-溶液中活化数小时）微量滴定管 217 型饱和甘汞电极 1M 和 0.1MNaC1 标准溶液 1M 和 0.1MKNO3溶液 0.01MAgNO3标准溶液 四、实验步骤四、实验步骤 1、直接电位法 工作曲线法 用移液管取 10ml，1MNaCl 标准溶液于 100 ml 容量瓶中，以 0.1MKNO3溶液稀释至刻度并摇匀，依次逐级稀释配得 10-110-5M 的 NaCl 标准系列，然后分别倒出约 25ml 溶液于 50ml 的烧杯中，插入连接好的氯离子选择电极和甘汞电极，在搅拌下依次从稀到浓的顺序测定各溶液的电极电位的稳定值。取 10ml 水样于 100ml 容量瓶中，加入 1MKNO315ml，用去离子水稀释至刻度并摇匀，依前述方法测得未知液的电极电位的稳定值。标准加入法 用移液管取 50ml 上述未知液于 100ml 烧杯中，按前述步骤测得其电位值 Ex 然后用移液管滴加0.1MNaCl 标准溶液 0.5ml 测得其电位值为 Es。2、电位滴定法 用移液管取 10ml 自来水于 50ml 烧杯中，加去离子水约 20ml，放入搅拌子，置于电磁搅拌器上。在搅拌下用 AgNO3标准溶液进行滴定。每加入一定体积的 AgNO3溶液，记录一相应电位值，开始滴定每次加入 0.2ml，估计到达等当点附近时，每次加入 0.05ml,过后仍每次加入 0.2ml 至电位变化不大后为止。五、结果处理五、结果处理 把上述实验所得数据，在计算机上进行处理，并打印出图及实验结果。六、思考题六、思考题 1、工作曲线中 KNO3的作用是什么？2、电位滴定法和一般容量滴定法有何异同？3、一个重现性差的电极能否用于工作曲线法和标准加入法？能否用于电位滴定法？13实验五实验五 维生素维生素 B12在玻碳电极上的伏安行为及测定在玻碳电极上的伏安行为及测定 一目的一目的 1通过对维生素 B12在玻碳电极上的伏安行为测试研究，了解影响其电化学性质有关因素，在最佳条件参数下对维生素 B12进行测定。2了解电化学工作站的基本原理；3掌握电化学工作站的基本操作；加深对灵敏度准确度空白等概念的认识。二原理二原理 电分析化学是仪器分析的一个重要组成部分。它是根据溶液或其它介质中物质的电化学性质及其变化规律来进行分析的一种方法，以电导电位电流和电量等电化学参数与被测物质的某些量之间的关系作为定量的基础。直流循环伏安法是与交流循环伏安法相对应的一种分析方法，常简称循环伏安法，它是以快速线性扫描的形式施加极化的三角波电压于工作电极，如图 a 所示，从起始电压 Ei开始沿某一方向变化，到达终止电压 Em后反方向回到起始电压，呈等腰三角形。电压扫描速度可以从每秒数毫伏到 1伏甚至更大。当溶液中存在氧化态物质 O 时，它在电极上可逆地还原成还原态物质 R，O+ne-R 当电位方向逆转时，在电极表面生成的 R 则可被可逆地氧化为 O，RO+ne-得到的极化曲线见图 b。图的上半部分是还原波，称为阴极支；下半部分是氧化波，称为阳极支。出现峰电流的原因和单扫描极谱法一样，其氧化波相当于溶液中的还原态物质在电极上氧化时的极化曲线，还原波即溶液中的氧化态物质在电极上还原时所得到的极化曲线。（用 ipaEpa分别表示氧化峰的峰电流和峰电位，而 ipcEpc分别表示还原峰的峰电流和峰电位。）14 E Em Ei 0 t 图 a 图 b 三试剂和仪器三试剂和仪器（1）仪器 LK2005 型 电化学工作站 LK2005 型 电化学工作站是天津市兰力科化学电子高技术有限公司最新研制开发的高档次多功能电化学分析仪器。该仪器提供的方法多，可以一机多用，即在同一台仪器上可以开展三十多种不同方法的电化学与电分析化学实验，使用灵活方便，实验曲线实时显示，全中文操作界面，使操作者在实验时更加直观、方便。另外该仪器的最小分辨力为 0.01mV，电流测量分辨力 0.1pA，可直接用于超微电极上的稳态电流测量，应用于有机电合成基础研究、电分析基础教学、电池材料研制、生物电化学（传感器）、阻抗测试、电极过程动力学研究、材料、金属腐蚀、生物学、医学、药物学、环境生态学等多学科领域的研究。例如测定环境样品（废水、废气、废渣等）中的污染物无机金属离子、有机物（酚类、酮类、芳香族化合物）污染分析，农药分析等；分析测定食品样品中金属离子、色素、味素、防腐剂、维生素、氨基酸、致癌物等；石油化工产品；理化分析、试剂分析、临床检验、药物与药物中间体分析、冶金分析、生化、放化及核污染分析等。该仪器可实现恒电位技术、线性扫描技术、脉冲技术、方波技术、交流技术、恒电流技术、高分辨率扫描技术、交流阻抗等电化学研究和分析方法。玻碳电极4mm为工作电极。Pt 丝电极为对电极。Ag/AgCl 为参比电极。金相砂纸Al2O3粉末。超声波清洗器。（2）试剂 维生素 B12储备液：110-3mol/L 15Britton-Robinson（B-R）缓冲溶液 KCl（分析纯）四实验内容四实验内容（1）溶液的配制 A.配制 110-3mol/L 的维生素 B12储备液，分别取适量储备液于容量瓶中配制成浓度分别为 0510-9110-8210-8310-8410-8510-8mol/L 的维生素 B12标准溶液，用于制作标准曲线。B.配制 pH=4.56 的 Britton-Robinson（B-R）缓冲溶液。在 100mL 三酸（磷酸硼酸乙酸，浓度分别为 0.04mol/L）中，加入 30.0 毫升 0.2mol/L 的 NaOH 溶液，即得 pH 值为 4.56 的缓冲溶液。C.取适量 KCl 固体粉末，配制成 0.1mol/L 的溶液。（本实验均用二次蒸馏水）（2）电极的处理 玻碳电极先用粗细金相砂纸磨光，然后用研细的 Al2O3粉在绸布上磨成镜面，最后在二次水中用超声波清洗。（3）标准曲线的制备 以 0.1mol/LKCl 溶液为支持电解质，把标准溶液分别 Britton-Robinson（B-R）缓冲溶液调节成pH 值为 4.56 的溶液从底浓度到高浓度在 0.2-1.2V 进行循环伏安扫描，记录 iE 曲线，扫描速度为 600mV/s，找出各浓度的最高还原峰，制作 ic 标准曲线。（4）未知样品的测定 取适量未知维生素 B12 样品溶液，以 0.1mol/LKCl 溶液为支持电解质，用 Britton-Robinson（B-R）缓冲溶液调节测试液 pH 值为 4.56，转移到电解池中进行阴极扫描，记录 iE 曲线，用校准曲线法测出该样品的浓度。（5）仪器操作步骤 A.打开计算机的电源开关，打开 LK2005 电化学工作站主机的电源开关。B.在 WindowsXP 操作平台下运行“LK2005.exe”，进入主界面。按下主机前面板的“复位”键，这时主控菜单上应显示“系统自检”界面（如图 11），待自检界面通过后，在“设置”菜单上选择“通讯测试”，此时主界面下方显示“连接成功”系统进入正常工作状态。C.选择测定方法，同时设定实验参数。D.分别按比例将配好的溶液加入烧杯中作底液。E.将三电极系统插入溶液中，连接到 LK2005 型 电化学分析系统，并确认电化学主机与微机系统连接正常，点击控制菜单中的开始实验即可。16五数据处理五数据处理 把上述实验所得数据在计算机上进行处理，并打印出图及实验结果。六思考题六思考题 1.何谓极谱法？何谓伏安法？二者区别？2.什么是循环伏安法？它有什么用途？17实验六实验六 配合物的组成及其稳定常数的测定配合物的组成及其稳定常数的测定 一、实验目的一、实验目的 掌握摩尔比法和等摩尔连续变化法测定配合物组成及稳定常数的基本原理和实验方法。二、实验原理二、实验原理 分光光度法是研究配合物组成和测定配合物稳定常数的一种十分有效的方法。如果金属离子 M和配位体 L 形成配合物，配合反应为 M nL MLn 式中，n 为配合物的配位数，可用摩尔比法或等摩尔 A 连续变化法测定。（1）摩尔比法：配制一系列溶液，维持各溶液的金属离子浓度、酸度、离子强度、温度不变，只改变配位体的浓度，在配合物的最大吸收波长处测定各溶液的吸光度 A，以吸光度 A 对摩尔比 R（RCLCM，CL为配位体浓度，CM为金属离子浓度）作图得到图 1。由图可见，当 Rn 时，配位体 L 全部转变为 MLn，吸光度 A 随 L 浓度增大而增高，并与 R 呈线性关系。当 Rn 时，金属离子 M 全部转变为 MLn，继续增加 L，吸光度不再增高。将曲线的线性部分延长，相交于一点，该点所对应的 R 即为配合物的配位数 n。摩尔比法要求在选定的波长下，除配合物外，配位体无明显的吸收，而且只能生成一种配合物。摩尔比法虽然简单、快速，但仅适用于离解度小的配合物。如果曲线的转折点很不明显，就难以确定配合物的组成。（2）等摩尔连续变化法：配制一系列溶液，在实验条件相同的情况下，保持溶液的总浓度不变，即 CM和 CL之和为常数，只改变溶液中 CM和 CL的比值。在选定的波长下，测定溶液的吸光度 A，将 A 对 CM/(CMCL)作图，如图 2 所示。当体系中只生成一种配合物时，曲线有一最高点，对应于该点的 CL/CM即为该配合物的配位数 n。如果配合物的稳定性好，曲线的最高点很明显。如果配合物部分离解，曲线的最高点附近比较圆滑，可将曲线的线性部分延长，找出其交点。图中 B点相当于配合物完全不离解时应有的吸光度，用 A表示。由于配合物部分离解，其离解度为 a=A-AA 由可以计算配合物的稳定常数 K：K=1-aMLna2 18 图 1 摩尔比法图示 图 2 等摩尔连续变化法图示 三、实验内容与步骤三、实验内容与步骤 本实验是测定铁（）磺基水杨酸配合物的组成及其稳定常数。实验在 pH 为 22 5 的 HCIO4溶液中进行，Fe3与磺基水杨酸生成紫红色配合物的最大吸收波长约为 500nrn。（1）摩尔比法实验：取 9 个 25mL 容量瓶，编号。按表 1 配制溶液，用去离子水稀释至刻度，摇匀。放置 05h，等显色稳定后，绘制吸收曲线，测定最大吸收波长下的吸光度。表 1 摩尔比法中溶液的配制及吸光度的测定 瓶号 HCIO4/mL Fe3/mL 磺基水杨酸/mL 吸光度 A 1 7.50 2.00 0.50 2 7.00 2.00 1.00 3 6.50 2.00 1.50 4 6.00 2.00 2.00 5 5.50 2.00 2.50 6 5.00 2.00 3.00 7 4.50 2.00 3.50 8 4.00 2.00 4.00 9 3.50 2.00 4.50 （2）等摩尔连续变化法实验：取 9 个 25mL 容量瓶，编号。按表 2 配制溶液，用去离子水稀释至刻度，摇匀。放置 0.5h 后，测定最大波长下的吸光度。表 2 等摩尔连续变化法中溶液的配制及吸光其 0AcM/cR+cM AA0A CR/CM n 19瓶号 HCIO4/mL Fe3/mL 磺基水杨酸/mL 吸光度 A 1 5.00 5.00 0 2 5.00 4.50 0.50 3 5.00 3.70 1.30 4 5.00 3.00 2.00 5 5.00 2.50 2.50 6 5.00 2.00 3.00 7 5.00 1.30 3.70 8 5.00 0.50 4.50 9 5.00 0 5.00 四、仪器与试剂四、仪器与试剂 仪器：岛津 UV2450 紫外可见分光光度计；容量瓶：25mL 9 个，100mL 2 个；移液管：5mL2 支，10mL I 支。试剂：Fe3溶液（1.000102molL1）：称取 048229g 分析纯 NH4Fe（SO4）212HClO4稀释至刻度；磺基水杨酸溶液（1.000102molL1）：02542g 磺基水杨酸（分子式 C6H3（OH）（COOH）SO3H12H2O），用 0025moIL-1 HCIO4溶解后，移至 100mL 容量瓶，再用 0.025molL1HClO4稀至亥度；HCIO4溶液（0.025 moIL-1）：移取 2.2 mL 70HClO4溶液，稀释至 1000mL（统一配制）。五、注意事项五、注意事项 在测定系列溶液的吸光度时，应按编号的顺序进行。六、数据处理六、数据处理（1）用摩尔比法定配合物组成：用表 1 中的数据，作吸光度 A 与 R 的关系图，将曲线的两直线部分延长相交于一点，确定配位数 n。（2）用等摩尔变化法确定配合物组成：根据表 6 中的数据，作吸光度 A 对 CM/(CMCL)的关系图。将两侧的直线部分延长，交于一点，由交点确定配位数 n。比较两种方法所得的 n 值。（3）按式 3 计算配合物的稳定常数。20七、思考题七、思考题（1）在何种情况下，可以使用摩尔比法、等摩尔连续变化法测定配合物的组成？（2）酸度对测定配合物的组成有何影响？如何确定适宜的酸度条件？（3）如果选用的总摩尔浓度增加 1 倍或稀释 1 倍，实验得到的曲线会有什么变化？对计算配合物的组成及稳定常数有何影响？岛津 UV2450 型紫外分光光度计使用说明 UV2450 操作步骤 1打开所有电源（电脑启动）2鼠标双击桌面上的 UVProbe 图标，启动程序。3单击“光度测定”图标，再单击“连接”图标。4等待自检完成（所有项目均为绿点），单击“确定”按纽。5单击“M（方法）”图标，选择测定参数：l）波长“类型”：点；并键入测定波长数值，单击“加入”纽。2）测定参数“样品重复”：键入重复数值。21 3）校准“类型”：选择原始数据单点。“公式”选择固定波长，“WL1”选择波长数值，“单位”键入 mgL 等，“标准浓度”键入数值（100）。4）仪器参数“测定方式”：选择吸收值，“狭缝宽”选择 2.0 5）单击“关闭”纽。6放置空白溶液，点击“自动调零基线”。7放置试样，键入“样品 ID标样 ID，单击“读取”纽。8保存打印测定数据。9单击“断开”纽，然后退出程序。10关闭所有电源。22实验七实验七 荧光分光光度法测定诺氟沙星片的含量荧光分光光度法测定诺氟沙星片的含量 一、实验目的一、实验目的 1、掌握荧光光度法的基本原理；2、了解荧光分光光度计的基本操作。二、实验原理二、实验原理 按照受激方法的不同，分子发光可分为不同类型。如果分子因吸收外来辐射的光子能量而被激发，所产生的发光现象称为光致发光；如果分子的激发能量是由反应的化学能或由生物体释放出的能量所提供，其发光现象分别称为化学发光和生物发光。通俗地讲，当紫外光或可见光照射某些物质时，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的波长更长的可见光，而当紫外光停止照射时，这种光线也随之很快地消失，这种光线称为荧光。按分子激发态的类型来划分时，由第一电子激发单重态的产生的辐射跃迁而伴随的发光现象称为荧光，而由最低的电子激发三重态所产生的辐射跃迁，其发光现象称为磷光，如图所示。荧光是物质在吸光之后发射出的波长较长的辐射，因此，溶液的荧光强度（F）与该溶液的吸光程度及溶液中荧光物质的荧光量子产率有关。荧光定量分析基于下式公式：F=2.303IObC=kC 式中:F 为荧光强度,Io 为入射光强度，为物质的荧光量子产率，为摩尔吸光系数，b 为光程，C 为荧光物质的浓度。以 FC 或 logFlogC 作图，即得标准曲线。样品测其 F 值后，根据标准曲线查得相应浓度，即可计算出含量。23三、试剂三、试剂 缓冲溶液的配制：（因实验中所需 pH=6 缓冲溶液多，故配制体积大)试剂 pH 2.0 4.0 6.0 8.0 0.2mol/L 磷酸氢二钠（ml）0.08 1.92 9.45 4.86 0.1mol/L 柠檬酸（ml）4.9 3.07 5.55 0.13 标准溶液的配制：精确称取 0.1000g 诺氟沙星（含量99.5%），溶于少许 0.1 mol/L NaoH 溶液中，用二次蒸馏水定容至 100ml 容量瓶中，此贮备液含量为 1000g/ml。使用时将贮备液逐级稀释为 1.0g/ml 操作液。四、实验步骤四、实验步骤 1、扫描诺氟沙星的激发光谱和发射光谱 取一支 10ml 比色管，分别加入 1.0g/mL 标液 2ml，pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 1ml，用二次蒸馏水定容至刻度并混匀，进行以下测定。（1）固定发射波长扫描激发光谱，从光谱图中确定诺氟沙星的最大激发波长（ex）；（2）固定激发波长扫描发射光谱，从光谱图中确定诺氟沙星的最大发射波长（em）。2、酸度的影响 取 4 支 10ml 比色管，分别加入 1.0g/ml 标液 2ml，各管再分别依次加入 pH2.0、pH4.0、pH6.0、和 pH8.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液各 1ml，用二次蒸馏水定容至刻度并混匀测定。固定步骤 1 确定的最大 ex 和最大 em，测定荧光强度（F）并记录数据。3、标准曲线 取 6 支 10ml 比色管，分别加入 1.0g/ml 标液 0，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00ml，分别依次加入 pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 1ml，用二次蒸馏水定容至刻度并混匀，同步骤 2 测定荧光强度（F）并记录数据。（线性范围 15g）。4、样品测定 称取 0.1g 诺氟沙星药片，加少许 0.1mol/L，NaoH 溶解后，用二次蒸馏水定容至 100ml 容量瓶中，取 1ml 该溶液稀释定容于 100ml 容量瓶中，再取 1ml 该稀释液加入 10ml 比色管中，并加 pH6.0缓冲液 1ml，用二次蒸馏水定容至刻度并混匀，同步骤 2 测定荧光强度（F）并记录数据。24五、数据处理五、数据处理：以 F 值对 pH 作图，绘制出 pH 影响曲线；以 F 值对 g 值作图，绘制出标准曲线，并求出回归方程计算样品 g 值后代入下列公式计算结果：g 值稀释倍数10-6 药片中诺氟沙星含量（%）=100 样品称重(g)六、思考题六、思考题 1、荧光强度测量与吸光度测量有何不同？为什么？2、物质的荧光强度与哪些因素有关？RF-5301PC 荧光分光光度计使用说明 工作原理 由光源氙弧灯发出的光通过切光器使其变成断续之光以及激发光单色器变成单色光后，此光即为荧光物质的激发光，被测的荧光物质在激发光照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光后照射于测样品用的光电倍增管上，由其所发生的光电流经过放大器放大输至记录仪，激发光单色器和荧光单色器的光栅均由电动机带动的凸轮所控制，当测绘荧光发射光谱时，将激发光单色器的光栅，固定在最适当的激发光波长处，而让荧光单色器凸轮转动，将各波长的荧光强度讯号输出至记录仪上，所记录的光谱即发射光谱（emission spectrum），简称荧光光谱。当测绘荧光激发光谱时，将荧光单色器的光栅固定在最适当的荧光波长处，只让激发光单色口的凸轮转动，将各波长的激发光的强度讯号输出至记录仪，所记录的光谱即激发光谱（excitation spectrum）。当进行样品溶液的定量分析时，将激发光单色器固定在所选择的激发光波长处，将荧光单色器固定至所选择的荧光波长处，由记录仪得出的信号是样品溶液的荧光强度。荧光分光光度计基本结构和原理图 25岛津岛津 RF-5301PC 型荧光分光光度计操作规程型荧光分光光度计操作规程 1.打开稳压器开关，待电压指示为 220V 时，将荧光光度计的右侧 Xe 灯开关置于“ON”的位置,再打开电源开关和电脑电源。2.双击 RF-530XPC 操作软件图标，仪器进入自检，待自检完成后，显示 RF-530PC 窗口。3.预热：开机预热 20 分钟后才能进行测定工作。4.新建文件夹：在 Data 文件夹里新建本次所做实验的子文件夹 光谱测定：1.在 Acquire Mode 中选择欲分析的项目。2.设定参数：根据测量方式在 Configure 的 Parameter 里设定合适的参数。3.置入样品：将已经装入样品的四面擦净后的石英荧光比色皿放入样品室内试样槽后,将盖子盖好。4.扫描：参数设定完毕后,点击窗口右下角的“Start”图标,开始扫描,扫图结束后输入文件名将文件储存。5.保存：在“File”中的“Save Channel”对曲线进行保存。6.点 manipulate/peak pick，激发光（或发射光）波长即被找出；7.点 presentation/plot 设置打印格式，点 preview 预览，点 print 打印即可。定量测定：1.acquire mode 选择 Quantitative 模式；2.编辑参数，设定多点工作曲线（multipoint working curve）或原始数据测定（raw data measurement）、激发光和发射光波长、狭缝等；3.点 standard;4.放入标准样品，点 read 后，输入浓度值；5.依次放入标准样品，做出标准曲线，点 presentation/display equation 显示公式；6.放入未知样，点 unknow