中华眼镜蛇细胞毒素致小鼠局部皮肤溃疡模型的构建研究_张志文.pdf

岭南急诊医学杂志2023年2月第28卷第1期基金项目：广东省广州市科技计划项目资助市校（院）联合项目（202102010282、202102010001）；广东省基础 与 应 用 基 础 研 究 基 金 资 助 面 上 项 目（2022A1515012095）作者单位：广州医科大学附属第一医院急诊科（510120）*通信作者中华眼镜蛇细胞毒素致小鼠局部皮肤溃疡模型的构建研究张志文黄君庭周红甜杨磊曹赞锋杨展正陈少英蒋敏梁子敬梁庆*摘要目的：探讨不同部位皮下注射中华眼镜蛇细胞毒素（CTX）致小鼠局部皮肤溃疡模型构建。方法：将57只小鼠随机分为5组：CTX组（n=18）、粗毒组（n=18）、CTX前肢组（n=7）、CTX后肢组（n=7）和CTX背部组（n=7），饲养21天观察皮肤溃疡坏死面积及病理变化。结果：CTX组造模成功率100%，粗毒组造模成功率仅5.5%。选择四肢皮肤注射 CTX 造模较背部成功率更高，不同注射部位溃疡伤口均可见典型炎症坏死表现。结论：CTX皮下注射小鼠后肢可构建成功率高，稳定，典型的中华眼镜蛇毒素中毒局部皮肤溃疡模型。关键词中华眼镜蛇；细胞毒素；小鼠；皮肤溃疡；动物模型DOI：10.3969/j.issn.1671301X.2023.01.002Establishment of Mice Model with Local Skin Ulcer induced by Naja Atra CytotoxinZHANG ZhiWen，HUANG JunTing，ZHOU HongTian，YANG Lei，CAO ZanFeng，YANG ZhanZheng，CHEN ShaoYing，JIANG Min，LIANG ZiJing，LIANG Qing*Department of Emergency Medicine，The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou，510120*Corresponding authorAbstractObjective：To investigate the model establishment of local skin ulcer induced by subcutaneous injection of Naja atra cytotoxin（CTX）in different parts of mice.Methods：57 mice were randomly divided into 5 groups：CTX group（n=18），Naja atra crude venom group（n=18），CTX forelimb group（n=7），CTX hindlimb group（n=7）and CTX back group（n=7），the area of skin ulcer necrosis and pathological changes were observed after feeding for 21days.Results：The success rate of CTX group molding was 100%，while that of crude venom group was only 5%.Thesuccess rate of CTX injection on the extremities was higher than that on the back，and the ulcers showed typical inflammation and necrosis.Conclusion：CTX subcutaneous injection in mouse hindlimbs can establish a stable and typical local skin ulcer model with high success rate.Key wordsNaja atra；cytotoxin；mouse；skin ulcer；animal model中华眼镜蛇属眼镜蛇科，是中国十大毒蛇之一，未分离提纯的蛇毒粗毒主要包括：细胞毒素（亦称为心脏毒素，cytotoxin，CTX）、神经毒素、磷脂酶A2，临床主要为细胞毒表现1。其中，CTX主要破坏磷脂双层结构致细胞膜裂解，是造成局部伤口坏死的主要毒素。中华眼镜蛇咬伤患者伤口常出现大片溃疡坏死，累及肌肉筋膜和骨膜，造成难治性蛇伤溃疡，甚至截肢/指而致残2。眼镜蛇咬伤所致蛇伤溃疡的治疗是国际难题，已有文献报道多种动物模型用于蛇伤溃疡研究3-5，但已报道模型在蛇伤溃疡不同部位观察及溃疡动态变化中的应用研究存在诸多不足，目前并无稳定成熟的小动物模型用于病理机制及治疗研究。本研究成功构建了稳定、存活率高的CTX致小鼠局部皮肤溃疡坏死动物模型。1材料与方法1.1CTX 与粗毒溶液的制备中华眼镜蛇 CTX 4岭南急诊医学杂志2023年2月第28卷第1期（2 mg/瓶，生产批号：210401，中鑫东泰（莱阳）纳米基因生物技术有限公司）；（2）中华眼镜蛇蛇毒粗毒冻干粉（购自中鑫东泰（莱阳）纳米基因生物技术有限公司）。造模前依据文献中提供的 1.5 倍CTX溃疡坏死剂量：47 g/（30 g-35 g）6或厂家提供的粗毒半数致死量0.53 mg/kg，按小鼠体重区间计算，称取CTX或粗毒，以纯化水分别配成CTX溶液（940 g/ml）及粗毒溶液（310 g/ml）备用。1.2实验动物与分组雄性 km 小鼠（购自广东省实验动物中心）57只，称取体重，随机分为5组：CTX 组（n=18）、粗毒组（n=18），CTX 前肢注射组（n=7）、CTX 后肢注射组（n=7）和 CTX 背部注射组（n=7），各组饲养在12 h昼夜循环光照恒温的动物室。所有动物实验均通过广州医科大学附属第一医院科研项目审查伦理委员会审批（编号：医研伦审2022第10号）。1.3模型建立CTX与粗毒对比：CTX组/粗毒组的小鼠右后肢大腿内侧皮肤备皮，皮下注射注入CTX/粗毒素。根据对比结果，选取CTX进行不同注射部位对比：小鼠右后肢上部内侧/右侧前肢上部内侧/右侧背部近脊柱0.5 cm处的皮肤备皮并皮下注射 CTX 溶液。造模成功标准：饲养第 5 天记录小鼠的存活数及伤口溃疡情况，存活且伤口最小横径0.5 mm，定义为模型制作成功，否则为造模失败6。1.4溃疡伤口大体观察饲养终点设定为小鼠皮下注射CTX溶液后21天、死亡或伤口愈合。饲养期间，每 3 天对伤口拍照，通过图像识别软件ImageJ 1.8进行伤口溃疡面积计算。1.5组织病理活检造模第 5 天，随机选取 1 只CTX后肢注射组小鼠，及健康小鼠1只，以颈椎脱臼的手法处死，取出右后肢皮肤，包埋后切片并HE染色，经2名有多年病理阅片经验的病理科医师阅片、审核、修改后，记录结果。1.6统计学方法采用 SPSS 20.0 进行统计分析。等级分类数据，使用卡方检验，设定检验标准P0.05。CTX 不同部位各个时间点 3 天内面积差属于偏态分布数据，进行多样本秩和检验，P0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1小鼠整体存活率及造模成功率比较饲养第5天观察小鼠存活率及造模成功率，见表1。2.2CTX 不同注射部位分组的小鼠存活率及造模成功率见表2。2.3CTX 不同注射部位致小鼠皮肤溃疡坏死面积差比较见图 1。小鼠前肢与背部的第 3 天及第 6 天的溃疡面积差均有显著差异（P 均0.05）；相较小鼠背部伤口，小鼠前肢伤口在第3天、第6天表现有明显差异；其余时间点，不同部位面积差无显著差异。不同部位面积差均表现出第9天接近0，提示小鼠伤口面积达峰；第9到第21天期间，伤口面积差基本0，说明小鼠伤口在第 9 到第 21天逐渐减少；第21天伤口面积差接近0，则提示小鼠伤口基本痊愈。2.3CTX 不同注射部位小鼠皮肤大体表现见图2。2.4组织病理观察见图3。表1粗毒组与CTX组小鼠存活率及造模成功率比较分组粗毒CTX个数1818生存数918死亡数90存活率50100*造模成功数118造模失败数170造模成功率5.5%100%*注：与粗毒组比较，*P0.05。表2CTX不同注射部位分组的小鼠存活率及造模成功率分组前肢后肢背部个数777生存数774死亡数003存活率100*100*57造模成功数773造模失败数004造模成功率100%*100%*42.80%注：与背部比较，*P0.05。图1CTX不同注射部位致小鼠皮肤溃疡坏死每3天面积差变化注：前肢与背部相比，*P0.05）。36912151821造模时间（天）1.503天面积差（cm2）1.000.500.00-0.50背部后肢前肢*5岭南急诊医学杂志2023年2月第28卷第1期3讨论毒蛇咬伤是被忽略的热带疾病，世界上约有5.8亿人有遭遇毒蛇的风险。每天有7400人被蛇咬伤，每年有 81000-138000 人死于毒蛇咬伤，约40万被咬伤者患永久性身体或心理残疾，包括失明、截肢和创伤后应激障碍等7。我国有210多种蛇类，广东地处岭南亚热带地区每月均有毒蛇咬伤，总体死亡率和致残率偏高8。在南非一项333名蛇伤病人研究中，最常见为眼镜蛇咬伤，其中282 例出现伤口肿胀，甚至出现骨筋膜室综合征9。文献报道 3319 例2毒蛇伤中，中华眼镜蛇咬伤951例；其中截肢、致残43例，40例为中华眼镜蛇咬伤引起。既往文献已报道多种中华眼镜蛇毒素中毒模型：中华眼镜蛇毒素（浓度5 mg/kg，200 ml/kg）可诱导广西巴马香猪出现皮肤及肌肉组织坏死，并连续观察 48 小时5；中华眼镜蛇蛇毒干粉（0.466mg/kg，8.0 l/kg）成功构建符合咬伤中毒临床特点的兔模型，观察 72 小时3；中华眼镜蛇蛇毒干粉（0.80 mg/kg，15.4 l/kg）成功构建符合临床特点的SD大鼠模型，观察72小时4等。上述动物模型可负荷较大的中华眼镜蛇毒素量，短期观察伤口变化，且伤口溃疡面积相对较大。但由于使用的动A AB BC C图2中华眼镜蛇CTX诱导小鼠局部皮肤溃疡坏死的大体表现注：A、B、C分别是背部、右后肢内侧，右前肢内侧。肉眼观察小鼠背部、后肢、前肢为注射中华眼镜蛇CTX溶液后第5天的皮肤表现，可见局部皮肤颜色变化，皮肤变色区域边缘变红，边缘不规则，形状不一，出现典型的皮肤坏死、溃疡形成及炎症表现。相较前肢与背部皮肤损伤情况，后肢的皮肤溃疡坏死更明显。10100上皮100皮下100毛囊5 m图3中华眼镜蛇CTX诱导小鼠局部皮肤溃疡坏死病理HE染色结果注：A-D为CTX组右后肢皮肤伤口，E-H为正常小鼠四肢皮肤。10倍光镜下CTX中毒组（A）小鼠皮肤连续性缺失，结构破坏，损伤深达皮下，出现大片坏死；100倍镜下CTX中毒组（B-D），坏死处上皮细胞减少，排列紊乱，大量有核细胞、炎症细胞侵润，皮下局部可见少量类似纤维蛋白的组织分布紊乱，皮下未见毛囊。正常小鼠（E-H）皮肤连续性好，上皮细胞呈单层排列，排列整齐，皮下结缔组织分层，且排列紧密，有序，毛囊可见数层，且排列规则整齐。A AB BC CD DE EF FG GH H 6岭南急诊医学杂志2023年2月第28卷第1期物体型偏大，购买、饲养成本较大，实验场地要求多，不易长期观察伤口。选用小鼠实验需求低，更适合长时间饲养观察。本实验发现使用中华眼镜蛇毒素（0.53 mg/kg）小鼠容易死亡。国内中华眼镜蛇蛇毒蛋白质组 学 分 析 结 果 提 示 蛇 毒 含 以 下 成 分：PLA2（46.5%），CTX（21.6%），SNTX（短链短神经毒素，11.1%）等1。因短链链神经毒素能竞争性抑制乙酰胆碱与受体结合，阻碍神经肌肉传递10，最终呼吸麻痹死亡，该毒理作用在小鼠上更明显。但47 g/（30 g-35 g）的 CTX 在 3 天内可诱导小鼠出现明显皮肤溃疡，且无神经表现6。本实验发现CTX造模的生存率及成功率均较粗毒高。本实验出现多只小鼠注射粗毒后 2 小时内死亡，因此不推荐粗毒用于造模。无论大型动物（猪、兔等）还是小型动物（大鼠、小鼠等）模型，均未关注毒素作用于不同部位的情况，也未进行较长时间（3天）的观察。本实验中CTX在不同部位注射后的小鼠伤口溃疡比较发现，第 5 天，小鼠后肢伤口溃疡比前肢、背部更明显。而对小鼠不同部位 3 天内面积差的比较，可见小鼠第3天、第6天，其前肢与背部相比有显著差异（P=0.011）：背部溃疡伤口第3天明显，而前肢、后肢第6天明显，第9天后小鼠不同部位的伤口均表现为皮肤修复，直至第21天。可见CTX能造成小鼠稳定溃疡伤口，而不危及小鼠生命，皮肤坏死表现典型，便于长期观察。综上所述，CTX 适用于诱导小鼠皮肤溃疡模型构建，具有高存活率、观察时间长、经济的特点。同时推荐注射CTX部位为后肢，因后肢皮肤溃疡伤口较背部明显，且比前肢便于操作，小鼠进食、舔舐活动对术后溃疡伤口的影响小。该小鼠溃疡伤口模型干预研究时机建议：四肢建议在第9天干预，而背部建议在第3天。参考文献1 Xiao G，Liu J，Peng L，et al.Compositional and toxicological investigation of pooled venom from farmraisedNaja atraJ.J Venom Anim Toxins Incl Trop Dis，2022，28：e20210040.2 钟健荣，朱弘海，夏婷婷，等.肇庆及周边地区毒蛇咬伤流行病学调查研究 J.蛇志，2020，32（04）：404.3 王璠.中华眼镜蛇咬伤中毒兔模型建立及其抗蛇毒血清作用时效性的研究 D.广西医科大学，2019.4 孙中毅.中华眼镜蛇咬伤中毒SD大鼠模型构建及其毒素循环路径的研究 D.广西医科大学，2020.5 关哲哲，李亚兰，胡少聪，等.中华眼镜蛇咬伤导致局部组织坏死的猪模型构建J.蛇志，2022，34（01）：1.6 Liu CC，Chou YS，Chen CY，et al.Pathogenesis of local necrosis induced by Naja atra venom：Assessment ofthe neutralization ability of Taiwanese freezedried neurotoxic antivenom in animal modelsJ.PLoS Negl TropDis，2020，14（2）：e8054.7 Minghui R，Malecela MN，Cooke E，et al.WHOsSnakebite Envenoming Strategy for prevention and controlJ.Lancet 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