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糖蛋白的提取分离纯化与表征
摘要：糖蛋白是由寡糖链与多肽链共价连接而成的一类结合蛋白质，是一类重要的生物大分子，在生物体内占有重要地位。本文综述了糖蛋白的分类、分离纯化及纯度鉴定方法研究，并介绍了某些糖蛋白的生理活性，对糖蛋白的开发利用具有借鉴作用。
关键词：糖蛋白，提取，分离纯化，纯度鉴定，生物活性
1 糖蛋白的简介
1.1糖蛋白的定义
糖蛋白是由小于15个单糖单位的寡糖链与蛋白质以共价键连构成的复合分子，在组成上以蛋白质为主。与其他大分子相比，糖蛋白的定义一直比较模糊，直至1908年美国生物化学家协会首次将糖蛋白定义为：由蛋白质分子和除核酸外的含有碳水化合物基团的物质共同组成的复合物(compounds of the protein molecules with a substance or substances containing acarbohydrate group,other than nucleic acid)(Montreuil et a1.,1995)。糖含量在不同糖蛋白中差别较为明显，通常情况下，总糖含量占蛋白重量的1％-60％不等，举几个例子：胶原蛋白含糖量一般不到1％，免疫球蛋白G低于4％，人红细胞膜的血型糖蛋白含糖量在54％左右。
随着糖和蛋白复合物领域研究的逐步深入，研究者将蛋白聚糖和糖蛋白区别开来，糖蛋白专指由比较短(通常不会超过15个单糖单位)、通常情况下具有多个分支的寡糖链与多肤链以共价键相连接的，含量上以蛋白为主的复合物；而蛋白聚糖在组成上以糖为主，且其糖链类型和连接方式均与糖蛋白有区别。近年来，糖蛋白的研究成为多门学科的研究前沿领域。相关研究者在医药学、生物化学、细胞生物学、免疫学以及食品科学领域都渗透进了糖蛋白的相关研究。
1.2糖蛋白的分类及分布
糖蛋白的主要由糖链和肽链两大部分构成。构成糖蛋白的单糖主要有(陈惠黎主编，1997)：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、 阿拉伯糖、木糖、N-乙酞葡萄糖胺、以及糖醛酸等。糖蛋白中较短的糖链和较长的肽链是通过糖肽键共价连接的。糖蛋白中按糖肽键连接方式不同糖蛋白可分为N-连接型糖链和O-连接型糖链，(1)N-连接型糖链糖蛋白：其特点是以天冬酞胺的酞胺基、N-末端氨基酸a-氨基以及赖氨酸或精氨酸-氨基为连接点，形成N-糖苷键型糖肽键，此类型糖蛋白糖链一般由以G1cNAc6为还原端，由六个到十个糖基构成；(2)O-连接型糖链糖蛋白：其结构特点是以苏氨酸、丝氨酸、和羟赖氨酸的轻基为连接点，形成O-糖昔键型。
在自然界中，糖蛋白以各种形式存在于细胞间质、细胞膜、血液及粘液中，包括许多激素、免疫球蛋白、粘液、结构蛋白、受体组分等。
1.3糖蛋白生物学功能
糖蛋白及其复合物是一类重要的生物活性物质，糖蛋白作为一种糖和蛋白质的复合物，具有多方面的生物活性，如抗氧化、免疫调节作用、体外抗肿瘤活性、抗糖尿病活性等，糖蛋白它可以存在于植物的细胞中，也可以存在于动物和微生物的细胞中，具有开关和调谐功能、激素功能、胞内转运功能、保护与促进物质吸收、参与血液凝固、参与细胞识别一系列作用。
2 糖蛋白的提取
糖蛋白的提取就是将糖蛋白从原料中分离出来的过程。包括以下几个阶段，材料的选择和预处理，细胞的破碎， 提取，浓缩 ，沉淀 ，干燥。糖蛋白是一类结合蛋白， 兼有多糖和蛋白质的某些性质，大多可溶于水及稀盐、 稀酸和稀碱溶液等，因此可根据需要采用不同的溶剂提取分离糖蛋白。但要注意，在所有这些步骤中必须保证糖蛋白生物大分子的完整性， 防止过酸、过碱、有机溶剂、高温、剧烈机械作用等破坏糖蛋白的结构而导致目的产物的生物活性丧失。常用的提取方法有：水提取法、稀盐溶液或缓冲液浸提法、酸碱溶液提取法、酶解法提取等。
2.1 水提取法
由于糖蛋白中糖链的高度亲水性（组成膜的糖蛋白除外），因此可用不同温度的水提取糖蛋白。有时在提取之前需要对原料进行脱脂处理，常用的方法是醚或醇回流。有报道，将藤壶全脏器匀浆，称取100g，加入600mL蒸馏水，于60℃下浸提4h，8层纱布过滤离心（12000r•min-1，20min，4℃，以下离心条件皆相同）,浓缩，无水乙醇沉淀24h，离心，沉淀冻干等步骤获得糖蛋白质粗品[1]；称取印尼白燕盏燕窝粉末0.2g，加入20mL蒸馏水，60℃浸提6h，10000rpm离心20min取上清液，重复提取三次，合并提取液，冻干得燕窝糖蛋白粗品[2]；取黄芪药材，粉碎成絮状，取一定量加水浸泡12 h，于<55℃水浴浸提2次，合并提取液，过滤，滤液离心(3 000r·min-1，30 min，下同)，浓缩上清液，加(NH4)2SO4至过饱和，于4℃静置过夜，离心，取沉淀，加适量水溶解，经sevage试剂脱蛋白，重复3次，直至无变性蛋白，将上清液置于透析袋透析，冷冻干燥，即得黄芪糖蛋白(AmGP一2)粗品[3]；称取一定量的怀山药片，加适量水，组织捣碎机粉碎后，在热水浴中浸提，离心，收集上清液，减压浓缩。加入氯仿：正丁醇=4：1(V／V)的Sevage试剂，以充分去除脂质、游离蛋白质，然后样液取水层透析，收集透析袋内液，离心，上清液即是山药糖蛋白粗品液[4]。
2.2 稀盐溶液或缓冲溶液浸提法
糖蛋白在稀盐溶液和缓冲溶液中稳定性好、 溶解度大， 这两种溶液是提取糖蛋白最常用的溶剂。有报道,将藤壶全脏器匀浆，称取500g，4℃下以2000 mL 0.2 moL•L-1（pH7.4）的磷酸盐缓冲溶液浸提12 h，上清液以硫酸铵盐进行分级沉淀，分别使硫酸铵含量达到40%、60%、100%三个级别，每级沉淀3h，离心,透析，冻干等步骤获得了糖蛋白的粗品[1]；
称取黄芪粉末100g，以l0倍量Tris缓冲液：Tris-HCl(25mM pH8．0)-NaCI(50mM)溶解，55℃浸提lh，纱布过滤，滤渣再以8倍量Tris缓冲液浸提lh后，纱布过滤，合并第一次滤液；离心取上清液，透析，冷冻干燥得粗蛋白质粗品。黄芪粉碎过二号筛，加10倍量的pH8.0 TrisCl(25mM)-NaCl(50mM)缓冲液，55℃水浴浸提lh，4200r／min的离心30min，取上清液弃去药渣，上清液4℃10000rpm离心20min，二次离心后上清液冷冻干燥，即得黄芪粗品糖蛋白[5]；藤壶全脏器匀浆，称取 50g，加入 1.5moL•L -1 NaCl 溶液 600mL，微波辅助提取（40℃，360 Hz，200W，9min），过滤，离心，梯度透析，冻干等步骤获得了糖蛋白粗品[1]；配制质量浓度为l％的紫芝胞外多糖蛋白复合物粗品溶液，冰浴中磁力搅拌器搅拌下分段缓慢加入(NH4)2SO4粉末至90％饱和度。4℃静置过夜，10000rpm冷冻离心10min，分别收集上清和沉淀，依次经蒸馏水和三蒸水透析除盐，冷冻干燥，得到上清的粗品EP及90％(NH4)2SO4盐析的沉淀样品[6]。
2.3 酸碱溶液提取法
由于糖蛋白兼具糖和蛋白质的性质，因此可根据蛋白质等电点法进行分离，若所含蛋白质偏酸性可采用碱提法分离，反之则用酸提法进行分离。同时也可根据糖链中O-连接的糖苷键在碱溶液作用下发生β-消除反应的性质采用碱提法分离糖蛋白，提取过程中可充注氮气或者加入适量的硼氢化钠来防止糖蛋白降解。有报道，用碱提法提取了鱿鱼缠卵腺M uci n型糖蛋白，提取率约为5％，其中蛋白含量22.6％，糖含量73.1％，硫酸根含量4.3％。采用酸碱溶液提取法提取过程中应注意对溶液pH的控制，溶液过酸过碱而造成的糖蛋白结构破坏[7]。
2.4酶法提取糖蛋白
对于难溶性糖蛋白，则可采用酶法提取，将不溶性的糖蛋白分解为可溶性的糖肽、游离肽或氨基酸。酶具有专一性，可以选择性地除去杂质。因而酶法提取也是糖蛋白制备过程中常用的方法。方旭波等用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶配合辅助提取了阿根廷鱿鱼喉软骨中白色纤维状的硫酸软骨素糖蛋白，其中软骨素含量95.31％，蛋白含量2.59％[8]。
3. 糖蛋白的分离与纯化
从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯净的，含有大量杂质，必须进一步分离纯化。这一阶段可分为粗分级分离和细分级分离两步进行。粗分级分离是将粗蛋白中的非糖蛋白组分除去，一般采用的脱蛋白方法为sevag法和硫酸铵分级法。此步主要是为了去除大量的游离蛋白和多糖，多糖不仅影响糖蛋白的SDS电泳还干扰糖蛋白的纯化、鉴定。一般蛋白质样品经粗分级后，体积较小，杂质大部分被除去。细分级分离就是进一步将蛋白质混合物中的目的单一组分分离出来，通常使用高分辨率的膜分离，纤维素离子交换柱层析法、凝胶柱层析法和亲和层析法。另外，因为只有活性的蛋白质才是我们需要的，在上述分离提取过程中，由于搅拌、升温、pH变化等使得维持蛋白质高级结构的氢键，疏水相互作用等弱的作用力不能再保持蛋白质的稳定构象，从而失去活性。失去活性的蛋白质就是杂质，不仅无用，有时还有毒。所以在上述分离提取步骤中有时有必要采取一些保护蛋白质活性的措施。如添加蛋白质稳定剂糖类，聚乙二醇等；或优化操作条件，如避光，温和的pH条件，低温等。
下面以紫红薯的糖蛋白的分离纯化为例来说明糖蛋白的分离纯化的具体步骤。
研究者将得到的紫红薯糖蛋白粗品利用了两种分离纯化方法的到紫红薯的糖蛋白纯品：先离子层析法，后用凝胶过滤层析法[9]。
紫红薯糖蛋白的DEAE-52纤维素柱层析：将处理好的DEAE-52纤维素湿法装柱(Φ1.5 cm×33 cm)，柱高为25 cm，用Tris-HCI缓冲液平衡柱床。粗糖蛋白粉末用双蒸水配成5 mg／mL溶液，吸取10毫升溶解液缓慢地加到纤维素柱面，然后分别用0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mol／L的NaHCO3进行分阶段洗脱，流速为1 mL／min，在280 nm处紫外检测器，自动部分收集器收集，每5 min收集一管，用考马斯亮蓝法测定在595 nm下的吸光度和苯酚．硫酸法检测在490 nm处吸光度，收集蛋白质和多糖重叠峰的洗脱液，4℃透析后真空冷冻干燥得到粗糖蛋白。
葡聚糖凝胶Sephadex G-75层析：将处理好的SephadexG-75湿法装柱(Φ1.5cm×33cm)，柱高为25 cm，用蒸馏水洗涤平衡柱床，将经DEAE-52纤维素纯化过的粗糖蛋白用蒸馏水配制成10 mg／mL，上样量为1 mL，用双蒸水进行洗脱，流速为1 mL／min，在紫外检测器280am处时出现峰时开始收集，每5 min收集一管，用考马斯亮蓝法测定在595 nm下的吸光度和苯酚．硫酸法检测在490 nm处吸光度，收集蛋白质和多糖重叠峰洗脱液，4℃透析后冷冻干燥较纯糖蛋白粉末样品。
4. 糖蛋白的含量测定
糖含量的测定：采用苯酚-硫酸法测定糖蛋白中的总糖含量。
蛋白质含量的测定：采用考马斯亮蓝法测定糖蛋白中的蛋白的含量。
5. 糖蛋白纯度鉴定
糖蛋白是大分子化合物，其纯度标准不能用通常的小分子化合物纯度标准来衡量，因为即便是糖蛋白纯品，在微观上也是不均一的。糖蛋白的纯度只代表某一糖蛋白相似链长的平均分布，糖蛋白的纯品实际上是指一定分子质量范围内的糖蛋白均一组分。
糖蛋白纯度鉴定常用的方法有凝胶层析法、亲和层析法、高效液相色谱法、高压电泳法、超速离心法、旋光法和毛细管电泳法等。凝胶柱层析法准确度较高，易于操作，是糖蛋白纯度鉴定中最常用的方法，若糖蛋白经凝胶层析得到单一对称洗脱峰，则证明该糖蛋白是均一组分。用于糖蛋白纯度鉴定的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、玻璃纤维纸电泳和醋酸纤维膜电泳等，若电泳后显色，糖和蛋白质的电泳图谱重合，呈单一色斑，则糖蛋白为均一组分。纯度检查一般要求应用两种以上方法鉴定，结果才能肯定。
有报道，研究者采用葡聚糖凝胶Sephadex G-75柱层析处理，分别测定山药糖蛋白的蛋白峰和糖峰，结果显示核酸蛋白仪检测和苯酚一硫酸法检测结果均为单一洗脱峰，且峰形对应，表明山药糖蛋白组分均一[10]；将分离得到的短裙竹荪菌丝体糖蛋白进行醋酸纤维膜电泳，分别用阿利新兰和考马斯亮兰染色，结果两者均显示单一斑带，且两者泳动距离相近；再将同样的菌丝体糖蛋白纯品经Sephadex G-200柱层析处理，分别测定蛋白峰和糖峰，结果显示蛋白质和糖的吸收峰分别只有一个，且吸收峰位置重合，峰形对称。两种方法测定结果表明该糖蛋白为均一物质[11]；采用SDS-PAGE电泳对山药糖蛋白纯品进行了分子质量的测定，电泳的结果只出现唯一的染色带，表明所得的山药糖蛋白已得到纯化[4]。
6. 糖蛋白的活性表征
6.1 抗氧化活性
自由基产生于人体生命活动的各种代谢反应，可加快机体的衰老，与一些疾病的发生、发展有密切关系。近年来，许多学者通过对天然动植物提取的糖蛋白的研究，发现多种糖蛋白可有效去除自由基，具有抗氧化活性。舒媛[12]等通过对未除蛋白质、Sevag法、蛋白酶法去除蛋白质后的3种山药粗多糖。继而测定其还原能力、清除过氧化氢能力、超氧阴离子自由基能力、羟自由基能力，均证实了3种山药粗多糖均具有抗氧化效果；罗秋水[9]等采用超氧阴离子自由基(OH)、羟基自由基(·OH)、1,1-二苯基-2-苯肼自由基(DPPH·)清除率测定法及还原力测定法评价紫红薯糖蛋白抗氧化活性，结果表明：在0-640 μg／mL浓度范围内，均具有明显的抗氧化活性，随着质量浓度的增加活性增强；其中在紫红薯糖蛋白的质量浓度为640 μg／mL时，对超氧阴离子自由基清除作用达到69.80％；对羟基自由基(·OH)的清除作用达到73.29％。
6.2降血脂活性
高血脂症是指血液中的一种或多种脂质成分的含量异常增高的症状，大量研究表明，糖蛋白有很好的降血脂的功效。于秋英[13]等对模拟高脂血症的小鼠，灌胃给以莼菜多糖蛋白体，结果发现它有降低血清胆固醇、甘油三酯、动脉粥样硬化指数、低密度脂蛋白及升高高密度脂蛋白的作用。李亚娜[14]等人从甘薯中分离得到一种甘薯糖蛋白，其具有显著降低高血脂症大鼠中血清胆固醇(TC)和甘油三脂（TG）的含量，尤其是血清胆固醇的含量(P<0．01)，甘薯糖蛋白降低血清胆固醇的效应，主要表现在升高升高高密度脂蛋白，降低低密度脂蛋白的作用，并且对肝脏胆固醇含量的升高也具有明显的抑制作用。
6.3抗肿瘤和免疫生物活性
目前使用的抗肿瘤药物会一定程度损害人体的正常细胞 、造成机体免疫功能衰退。取 自天然原料的糖蛋白对细胞没有毒害作用 ，对于提高免疫活性和抗肿瘤 的研究具有重大意义。詹玲[15]等通过大豆糖蛋白对小鼠免疫器官的影响的试验证实其对小鼠的免疫器官没有显著的影响。继而通过小鼠的碳粒廓清实验证实其能显著地提高小鼠的中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬能力，即提高了小鼠的非特异性免疫功能活性。而经过大豆糖蛋白对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响试验证实只有高剂量的大豆糖蛋白才能提高小鼠的特异性免疫。钱建亚[16]经过Ames实验证实甘薯糖蛋白有明显的抑制叠氮钠致回复突变的能力，且抗突变作用随剂量的增大而加强。其又通过体外抗肿瘤试验证实甘薯糖蛋白能明显抑制肿瘤细胞的增殖，而对正常的细胞并没有影响。
7. 展望
糖蛋白具有多种生理功能，在药学、生物化学、生物工程学及食品科学等领域逐渐受到重视，人们对其生理活性和应用价值也有了更深一步的认识。随着医药学、糖生物学、现代分离纯化技术和鉴定技术的发展，糖蛋白的结构与功能之间及糖蛋白与疾病之间的关系及机制研究也将进一步深入。
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