第四章酶的固定化.pptx

第五章酶工程与食品科学第五章酶工程与食品科学 之之 酶的固定化酶的固定化为什么要进行酶的固定化:稳定性差稳定性差 催化结束后难以回收催化结束后难以回收 目前固定化对象目前固定化对象:从酶扩增到从酶扩增到微生物或动植物细胞和各种微生物或动植物细胞和各种细胞器细胞器第一个将固定化细胞用于工业化：第一个将固定化细胞用于工业化：年日本千田一郎，用于连续化生产年日本千田一郎，用于连续化生产天冬氨酸天冬氨酸中国：年，江苏某高校在世界上首次实现大规模固定化微生物细胞工业化生产天然食品添加剂酒石酸（现达到5,000吨/年，国家火炬计划项目2004EB020341），改变了单一依靠葡萄酒酒石提取的传统工艺。目前世界上只有中国能用生物技术方法生产L-酒石酸。什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术化学偶联酶酶固定化固定化间歇间歇可溶可溶交联包埋吸附间歇间歇连续连续酶的固定化技术酶的固定化技术固定化酶的特点：优点：优点：1.不溶于水，易于与产物分离；不溶于水，易于与产物分离；2.可反复使用；可反复使用；3.可连续化生产；可连续化生产；4.稳定性好。稳定性好。缺点：缺点：固定化过程中往往会引起酶的失活固定化过程中往往会引起酶的失活一、酶的固定化方法1.载体结合法载体结合法 物理吸附物理吸附 离子吸附离子吸附 鏊合法鏊合法 共价结合法共价结合法2、共价交联、共价交联3、包埋法、包埋法a.物理吸附法:是制备固定化酶最早采用的方法，它是制备固定化酶最早采用的方法，它以固体表面物理吸附为依据，使酶一水不溶性载体以固体表面物理吸附为依据，使酶一水不溶性载体相接触而达到酶吸附的目的相接触而达到酶吸附的目的1、载体结合法优点：固定化时酶分子的构象很少或基本不发生变化。缺点：结合力弱(物理吸附)，易解吸附。载体：纤维素、琼脂糖、活性炭、沸石及硅胶等。b.离子吸附法离子吸附法 通过离子效应将酶分子固定到含有离子交换基团的固相载体.其实质不溶性离子化合物(离子交换剂)上的可交换离子与溶液中的其它同性离子的交换反应，是一种特殊的吸附过程，是可逆性化学吸附。第一个离子吸附法固定化酶：第一个离子吸附法固定化酶：DEAE(二乙氨基乙醇)Cellulose（纤维素）固定化过氧化氢酶第一个工业化的固定化酶第一个工业化的固定化酶：DEAE-Sephadex A-50固定化氨基酰化酶优点：反应条件温和，固定化酶活性高反应条件温和，固定化酶活性高。缺点：结合不牢固，酶在高浓度底物，高离子强度或pH变化时易脱落。载体：DEAE-纤维素纤维素、CM（甲基）-衍生物等C、金属的氢氧化物和氧化物利用螫合作用将酶直接赘合到表面含过渡金属化螫合作用将酶直接赘合到表面含过渡金属化合物的载体上，具有较高的操作稳定性合物的载体上，具有较高的操作稳定性。能与酶中的羧基，羟基和氨基结合螫合作用：螫合作用：某些有机化合物中，其部份相邻原子上，互有多余的电子对，可与外来的二价金属离子(例如ni2+，co2+，cu2+等)共同组成环状(ring)，类似螃蟹的两支大螯般共同夹住外物一样，称之为螫合作用。具有这种功能的化合物者，称为chelatingagent。如edta(乙二胺基四醋酸)，eta等都是常见的螯合剂d.共价结合法共价结合法是共价结合法是通过酶分子上的通过酶分子上的功能团，与载体功能团，与载体表面上的反应基表面上的反应基团发生化学反应团发生化学反应形成共价键的一形成共价键的一种固定化方法，种固定化方法，是研究最多的固是研究最多的固定化方法之一。定化方法之一。优点；结合牢固缺点；酶容易失活2、共价交联法 通过双功能或多功能试剂，在酶分子间或酶分子和通过双功能或多功能试剂，在酶分子间或酶分子和微生物细胞间形成共价键的连接方法。这些具有两种相微生物细胞间形成共价键的连接方法。这些具有两种相同或不同功能基团的试剂叫做交联剂。常见的交联剂有同或不同功能基团的试剂叫做交联剂。常见的交联剂有顺丁烯二酸配和乙烯共聚物、戊二醛等，其中以顺丁烯二酸配和乙烯共聚物、戊二醛等，其中以戊二醛戊二醛最为常用。最为常用。O OH C CH2 CH2 CH2 C H第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶 得到一种分子间得到一种分子间交联的固定化酶交联的固定化酶优点优点:结合牢固结合牢固缺点缺点:反应较为激烈反应较为激烈,酶活回收率低酶活回收率低 因此因此,在交联的时候尽量降低交联剂的浓度和缩短反应时间在交联的时候尽量降低交联剂的浓度和缩短反应时间图图 711 酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子；（酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶共价结合法和共价交联法区别表表72 常用于固定化酶的交联剂常用于固定化酶的交联剂 交联剂交联剂 戊二醛戊二醛二重氮联苯胺二重氮联苯胺2，2二磺酸二磺酸4，4二氟二氟3，3二硝基二苯砜二硝基二苯砜 二苯基二苯基4，4二硫氰酸二硫氰酸2，2二磺酸二磺酸 1，5二氟二氟2，4二硝基苯二硝基苯 酚酚2，4二磺酰氯二磺酰氯 3甲氧基二苯基甲烷甲氧基二苯基甲烷4，4二异氰酸盐二异氰酸盐 3、包埋法包埋法将酶包埋在高聚物凝胶网格中或高分于半透膜内的固将酶包埋在高聚物凝胶网格中或高分于半透膜内的固定方法；前者又称为定方法；前者又称为凝胶包埋法凝胶包埋法，后者则称为，后者则称为微囊法微囊法。包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基起结合反应，包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基起结合反应，较少改变酶的高级结构，酶的回收率较高；但它较少改变酶的高级结构，酶的回收率较高；但它仅适用于仅适用于小分于底物和产物的酶小分于底物和产物的酶，因为只有小分子物质才能扩散进，因为只有小分子物质才能扩散进入高分子凝胶的网格，并且这种扩散阻力还会导致固定化入高分子凝胶的网格，并且这种扩散阻力还会导致固定化酶动力学行为的改变和活力的降低。酶动力学行为的改变和活力的降低。微囊法：微囊法：是利用各类型的膜将酶封闭起来，这类是利用各类型的膜将酶封闭起来，这类膜能使低分子产物和底物通过，而酶和其他高分膜能使低分子产物和底物通过，而酶和其他高分于物质不能通过。于物质不能通过。纤维包埋法：纤维包埋法：是将酶包埋在合成纤维的微孔穴中是将酶包埋在合成纤维的微孔穴中的方法，其优点是成本低、可用于酶结合的表面的方法，其优点是成本低、可用于酶结合的表面积大，有优良的抗微生物和抗化学试剂的性能，积大，有优良的抗微生物和抗化学试剂的性能，最常用的聚合物是醋酸纤维最常用的聚合物是醋酸纤维素。方法 酶硝酸纤维素D半乳糖苷酶天门冬酰胺酶火棉胶（硝化纤维素）醇脱氢酶苹果酸脱氢酶丙酮酸激酶脲酶有无微胶囊化的固定化酶活力比较有无微胶囊化的固定化酶活力比较无微胶囊化微胶囊化固定化酶活力(U/g)冲刷后酶活力(U/g)酶活保留率(%)微胶囊后酶活力(U/g)酶活保留率(%)冲刷后酶活力(U/g)酶活保留率(%)301.150.3530.3%0.9784.3%0.6163.3%601.40.3424.3%1.2589.3%0.7761.7%有无微胶囊化的酶活保留率变化曲线二、细胞的固定化方法二、细胞的固定化方法1、包埋法包埋法：将细胞包埋在多微孔载体内部制备固：将细胞包埋在多微孔载体内部制备固定化细胞的方法，可分为定化细胞的方法，可分为凝胶包埋法、纤维包埋凝胶包埋法、纤维包埋法和微胶囊包埋法法和微胶囊包埋法。其中凝胶包埋法是应用最广。其中凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动植泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动植物细胞的固定化。物细胞的固定化。它的最大优点是能较好地保持它的最大优点是能较好地保持细胞内的多酶反应系统的活力，可以像游离细胞细胞内的多酶反应系统的活力，可以像游离细胞那样进行发酵生产。那样进行发酵生产。2、吸附法主要是利用细胞与载体之间的吸引力吸附法主要是利用细胞与载体之间的吸引力（范（范德华力、离子键和氢键），德华力、离子键和氢键），使细胞固定在载体上，使细胞固定在载体上，常用的吸附剂有常用的吸附剂有玻璃、陶瓷、硅藻土、多孔塑料、玻璃、陶瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤维等中空纤维等。此外还可利用此外还可利用专一的亲和力来固定细胞专一的亲和力来固定细胞，例如伴刀豆球，例如伴刀豆球蛋白与一甘露聚糖具有亲和力，而酿酒酵母细胞壁上含蛋白与一甘露聚糖具有亲和力，而酿酒酵母细胞壁上含有一甘露聚糖，故可将伴刀豆球蛋白先连接到载体上，有一甘露聚糖，故可将伴刀豆球蛋白先连接到载体上，然后把酵母连接到活化了的伴刀豆球蛋白上。然后把酵母连接到活化了的伴刀豆球蛋白上。三、固定化酶（细胞）的性质三、固定化酶（细胞）的性质在水溶液中游离酶分子与底物同处于液相，十分邻近，而酶被固定化后，则处于载体的特定的微环境中。由于载体的物理性质对酶与底物作用的影响，酶的性质发生了变化。(1)酶活力的变化：酶活力的变化：固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，专一性也可能发生变化，其原因可能是：活力低，专一性也可能发生变化，其原因可能是：酶构象的改变导致了酶与底物结合能力或催化底物转酶构象的改变导致了酶与底物结合能力或催化底物转 化能力的改变；化能力的改变；载体的存在给酶的活性部位或调节部位造成某种空间障载体的存在给酶的活性部位或调节部位造成某种空间障 碍，影响酶与底物或其他效应物的作用；碍，影响酶与底物或其他效应物的作用；底物和酶的作用受其扩散速率的限制。在个别情况下，底物和酶的作用受其扩散速率的限制。在个别情况下，固定化酶由于抗抑能力的提高使得它反而比游离酶活力高。固定化酶由于抗抑能力的提高使得它反而比游离酶活力高。图5.5 温度对鸡肝酯酶活力的影响(2)酶稳定性提高：酶稳定性提高：酶稳定性包括热稳定性、酶稳定性包括热稳定性、对各种有机试剂的稳定性、对对各种有机试剂的稳定性、对PH的稳定性、的稳定性、对蛋白水解酶的抗性及储存稳定性等。对蛋白水解酶的抗性及储存稳定性等。第一，固定化增加了酶构象的牢固程度。第二、挡住了不利因素对酶的侵袭。第三，限制了酶分子间的相互作用。但是，如果固定化 触及到酶活性敏感区域，也可能导致酶稳定性下 降。(3)最适最适pH值的变化值的变化：酶固定化后，催化底物的最适：酶固定化后，催化底物的最适PH值和值和pH活性曲线常发生变化，其原因是微环境表面电荷的影活性曲线常发生变化，其原因是微环境表面电荷的影响。响。带负电荷的载体，往往导致固定化酶的最适pH向碱性方向移动；带正电荷的载体则相反。例如：DEAE纤维素或DEAE葡聚糖固定化氨基酰化酶与其游离酶比较，低0.5个pH而偏向酸性方向。CM一纤维素固定化的胰蛋白酶、糜蛋白酶的最适pH与游离酶比较，向碱性方向偏移0.51个pH单位。尽管大多数固定化酶的活力pH关系曲线仍为钟形曲线，但与溶液酶比较，其钟形更陡，或更坦，向酸性或碱性方向偏移。图5.4 固定化和游离鸡肝酯酶的相对酶活力与pH的关系 (4)最适温度的变化最适温度的变化 在一般情况下，固定化后的酶失活速度在一般情况下，固定化后的酶失活速度 下降，所以最适温度也随之提高，这是非常有利的结果。下降，所以最适温度也随之提高，这是非常有利的结果。(5)动力学常数的变化动力学常数的变化 酶固定于电中性载体后，表观米氏常数往往比游离酶的酶固定于电中性载体后，表观米氏常数往往比游离酶的米氏常数高，而最大反应速度变小；而当底物与具有带相反米氏常数高，而最大反应速度变小；而当底物与具有带相反电荷的载体结合后，表观米氏常数往往减小，这对固定化酶电荷的载体结合后，表观米氏常数往往减小，这对固定化酶实际应用是有利的。此外，动力学常数的变化还受溶液中离实际应用是有利的。此外，动力学常数的变化还受溶液中离子强度的影响，在高离子强度下，酶的动力学常数几乎不变。子强度的影响，在高离子强度下，酶的动力学常数几乎不变。(1)相对酶活力相对酶活力:具有相同酶蛋白量的固定化酶与游具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力的比值称为相对酶活力离酶活力的比值称为相对酶活力.它与载体结构、颗粒大小、底物分子量大小它与载体结构、颗粒大小、底物分子量大小及酶的结合效率有关及酶的结合效率有关.相对酶活力低于相对酶活力低于75%的固定的固定化酶化酶,一般没有实际应用价值。一般没有实际应用价值。四四 固定化酶的指标固定化酶的指标(2)酶的活力回收率酶的活力回收率:固定化酶的总活力与用于固定化的酶的固定化酶的总活力与用于固定化的酶的活力之百分比称为酶的活力回收率活力之百分比称为酶的活力回收率 将酶进行固定化时将酶进行固定化时,总有一部分酶没有与载体结合在总有一部分酶没有与载体结合在一起一起,测定酶的活力回收率可以确固定化的效果测定酶的活力回收率可以确固定化的效果.一般情况一般情况下下,活力活力 回收率应小于回收率应小于1,若大于若大于1可能由于固定化活细胞增可能由于固定化活细胞增殖或某些抑制因素排除的结果殖或某些抑制因素排除的结果.(3).酶固定化效果的测定固定化酶活力测定基本上与溶液酶相似，也以反应初速度表示即每毫克干重固定化酶每分钟转化1umol底物量或形成1umol产物的酶量为一个单位(umol/mgmin)，对于酶管、酶膜、酶板等，则以单位面积（cm2）的初速度来表示。4.固定化酶半衰期:固定化酶的活力下降到初始活力一半所经历的时间,用t2/1表示，衡量固定化酶操作稳定性的关键。